本文關(guān)鍵詞： 膽固醇-半乳糖苷配體 酶促反應(yīng) 肝靶向性 抗腫瘤活性 紫杉醇脂質(zhì)體　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：半乳糖受體是一種廣泛分布在哺乳動(dòng)物肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的受體,又被稱為去唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoprotein receptor, ASGPR),能夠應(yīng)用于構(gòu)建肝細(xì)胞特異性靶向脂質(zhì)體。紫杉醇(Paclitaxel, PTX)是紅豆杉中提取的四環(huán)二萜類化合物,是一種廣譜抗癌藥物；臨床研究表明對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷能力可與氟尿嘧啶相當(dāng)而副作用較小。探究紫杉醇納米制劑對(duì)肝癌的治療是目前紫杉醇研究開發(fā)的新目標(biāo)。本課題首先酶促合成膽固醇-半乳糖苷,將其作為配體制備膽固醇-半乳糖苷修飾紫杉醇配體脂質(zhì)體,利用半乳糖配體的肝靶向性,使修飾物在肝臟富集,更有效地發(fā)揮紫杉醇抗肝癌的作用；同時(shí),考察該配體脂質(zhì)體的處方、制備工藝、基本理化性質(zhì)和穩(wěn)定性,并且以紫杉醇注射液和普通紫杉醇脂質(zhì)體為參比制劑,對(duì)該配體脂質(zhì)體的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)、組織分布、體外的抑制腫瘤細(xì)胞活性進(jìn)行深入探討,為紫杉醇開發(fā)成抗肝癌新型靶向制劑提供理論支撐。方法：1.膽固醇-半乳糖苷的酶促合成、分離純化、結(jié)構(gòu)表征及穩(wěn)定性考察以吡啶：丙酮(2：1,v/v)混合溶劑作為溶媒,利用Novozym 435固定化脂肪酶的催化,在一定溫度下,乳糖醇與膽固醇癸二酸二乙烯單酯酯化生成膽固醇-半乳糖苷配體。采用單因素考察分析各因素對(duì)該酶促酯化反應(yīng)的影響規(guī)律,Box-Behnken效應(yīng)面法設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化工藝參數(shù)。通過層析柱分離純化產(chǎn)物；建立膽固醇-半乳糖苷含量的HPLC分析方法；利用TLC、MS、IR、NMR等技術(shù)分析鑒定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特征。通過影響因素、加速試驗(yàn)考察該配體的穩(wěn)定性。2.膽固醇-半乳糖苷修飾的紫杉醇配體脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)研究在脂質(zhì)材料中加入適當(dāng)比例(w%)的膽固醇-半乳糖苷,采用薄膜分散法,水化孵育、超聲、微孔濾膜過濾后,制備了紫杉醇配體脂質(zhì)體；通過單因素考察和正交設(shè)計(jì)法,優(yōu)選最佳處方,獲得質(zhì)優(yōu)、穩(wěn)定的脂質(zhì)體;考察紫杉醇配體脂質(zhì)體的外觀、粒徑、zeta電位、包封率。3.紫杉醇配體脂質(zhì)體在SD大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)及KM小鼠組織分布學(xué)研究以紫杉醇(Paclitaxel, PTX)為目標(biāo)藥物,制備PTX-i普通注射液、PTX-L普通脂質(zhì)體和Gal-PTX-L配體脂質(zhì)體三種制劑；SD大鼠、KM小鼠作為動(dòng)物模型,通過尾靜脈注射方式給藥,分別考察這三種紫杉醇制劑在機(jī)體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù),以及在心、肝、脾、肺、腎等組織的分布；利用甲基叔丁基醚(MTBE)萃取法分離出血漿中的PTX,以多烯紫杉醇(Docetaxel, DOC)為內(nèi)標(biāo)物計(jì)算PTX血藥濃度；DAS 2.1軟件分析藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。4.紫杉醇配體脂質(zhì)體的體外抗HepG2細(xì)胞活性研究在體外抗腫瘤試驗(yàn)中,大量培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株,接種適量HepG2細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板,實(shí)驗(yàn)分四組：陰性對(duì)照組、PTX注射液組、PTX-1組、Gal-PTX-L組,以給藥24-48-72 h后,通過CCK(四唑單鈉鹽類)法和LDH(乳酸脫氫酶)法分別測(cè)定細(xì)胞存活率、三種含紫杉醇的藥物的IC50和細(xì)胞釋放的LDH活性(IU/L),進(jìn)而綜合評(píng)價(jià)該Gal-PTX-L制劑的抗腫瘤療效優(yōu)勢(shì)。結(jié)果：1.膽固醇-半乳糖苷的酶促合成、分離純化、結(jié)構(gòu)表征及穩(wěn)定性利用酶法成功制備了膽固醇-半乳糖苷配體,考察了酶的種類、加酶量、反應(yīng)介質(zhì)、反應(yīng)溫度、底物摩爾比、反應(yīng)時(shí)間等單因素對(duì)酶催化的影響,建立了Box-Behnken效應(yīng)面模型,獲得最優(yōu)反應(yīng)條件：乳糖醇(Lactitol, LA)與膽固醇癸二酸單烯酯(Cholesteryl hemi-vinyl sebacate, CHS-DD)摩爾比1：3.7,Novozym 435 22.8 mg,吡啶：丙酮(2:1,V/V) 2.1 mL,溫度55℃,反應(yīng)時(shí)間31.2 h,該條件下產(chǎn)率可達(dá)94%以上。通過簡(jiǎn)單的柱層析流程,分離純化膽固醇-半乳糖苷配體分子。經(jīng)過TLC、MS、IR、NMR等技術(shù),確證了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征。根據(jù)影響因素試驗(yàn)的結(jié)果,該配體的包裝應(yīng)密封,放置在干燥、陰涼、避光處。2.膽固醇-半乳糖苷修飾的紫杉醇配體脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)研究以紫杉醇(PTX)為目標(biāo)藥物,制得PTX普通脂質(zhì)體、PTX半乳糖基化脂質(zhì)體。建立了脂質(zhì)體中包合的PTX的HPLC含量測(cè)定法,通過線性、專屬性、精密度、回收率、重復(fù)性和穩(wěn)定性考察,證明該方法適用、可靠。選取藥脂比、磷脂與膽固醇比和膽固醇-半乳糖苷用量(w%)為考察對(duì)象,包封率(%)為評(píng)價(jià)指標(biāo),設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化脂質(zhì)體制備工藝參數(shù),獲得最佳工藝條件為：磷脂與藥物的質(zhì)量之比為4：1,磷脂與膽固醇的質(zhì)量之比為5：1,膽固醇-半乳糖苷用量(w%)為8%。在最優(yōu)工藝下,制備三份樣品,顯示包封率86%以上,粒徑保持在160nm左右。3.紫杉醇配體脂質(zhì)體在SD大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)及KM小鼠組織分布學(xué)研究首先建立了血漿中PTX濃度的LC-MS/MS測(cè)定方法,通過方法學(xué)考察證明了該方法適用、可行；考察了血液樣品的萃取藥物方法,證實(shí)甲基叔丁基醚萃取效果更佳,符合分析的要求；三種制劑經(jīng)大鼠尾靜脈給藥(5mg/kg)后,半衰期T1/2z(h)分別是4.26±0.72 (PTX-i),2.83±1.28 (PTX-L),3.32±2.05 (Gal-PTX-L);表觀分布容積Vz(L/kg)分別是9.44±2.28 (PTX-i),3.89±1.03 (PTX-L),16.11±6.23 (Gal-PTX-L);清除率CLz(L/h/kg)分別為1.46±0.17 (PTX-i),1.12±0.35 (PTX-L),4.06±1.55(Gal-PTX-L)。另外,經(jīng)小鼠尾靜脈給藥后,紫杉醇普通脂質(zhì)體、紫杉醇配體脂質(zhì)體肝靶向參數(shù)Re分別是0.105和4.103；Te(%)為3.083和56.112；RTe為0.117和2.105；Ce為0.109和3.298。4.紫杉醇配體脂質(zhì)體的體外抗HepG2細(xì)胞活性研究在0.1μg/mL劑量下,PTX-i組、PTX-L組、Gal-PTX-L組的24h細(xì)胞存活率分別為：50.08%,26.25%和11.38%；48h細(xì)胞存活率各是：45.84%,32.25%和19.17%；72h細(xì)胞存活率為：43.03%,28.45%和24.85%。另外,三組藥物的IC50分別是0.438μg/mL,0.121μg/mL和0.037μg/mL。藥物干預(yù)后三組藥物的培養(yǎng)液中24 h LDH的活性分別是20.14 IU/L,27.67 IU/L和39.37 IU/L;48h LDH的活性分別是34.60 IU/L,51.74 IU/L和65.11 IU/L; 72h LDH的活性分別為48.98 IU/L,65.20 IU/L和80.91 IU/L。結(jié)論：綜上所述,膽固醇-半乳糖苷的合成及其紫杉醇配體脂質(zhì)體的研究,提供了一種新穎、高效和穩(wěn)定的將半乳糖基化脂質(zhì)體藥物運(yùn)送至HepG2靶細(xì)胞并發(fā)揮抗腫瘤活性的途徑。通過藥物動(dòng)力學(xué)和組織分布研究,確認(rèn)了紫杉醇配體脂質(zhì)體比普通制劑具有更好的肝靶向性,更容易在肝臟蓄積;在體外抗肝腫瘤細(xì)胞研究中,表明紫杉醇配體脂質(zhì)體能夠發(fā)揮良好抑制肝腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的療效,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。因此,我們有理由相信紫杉醇配體脂質(zhì)體在肝病治療中擁有廣闊的應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R943;R96

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1546525