本文關鍵詞： 微囊藻毒素-LR HepG2細胞 細胞毒性 毒性機制 轉錄組 miRNA表達譜　出處：《河南師范大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：水體富營養(yǎng)化導致藍藻水華的頻繁發(fā)生已成為國內外普遍關注的水環(huán)境污染問題。藍藻水華不僅污染水體、破壞飲用水源、造成漁業(yè)損失,而且多數藍藻水華還由于產生藍藻毒素(cyanotoxins)而影響和危害水生生物甚至人的健康。在眾多藍藻毒素中,微囊藻毒素(microcystins,MCs)是分布最廣且毒性最強的一類環(huán)七肽肝毒素。目前已發(fā)現超過100種MCs異構物,它們具有廣譜的生物毒性,且化學性質穩(wěn)定,在自然水體中難以降解。因此,它們對人類健康的影響尤其令人關注。近年來,關于MCs對動物或細胞的毒性及其作用機制的探索已成為MCs毒理學研究的重點和熱點。關于MCs的毒性作用及其機理研究雖然有很多新的發(fā)現和見解,但其作用的具體信號通路目前尚不完全清楚,而且存在一定的爭議,而該問題的解決是進行MCs環(huán)境和健康風險評價的基礎。本研究選擇MCs異構體中最常見且毒性最大的微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR),以人肝癌細胞Hep G2作為實驗模型,研究MC-LR對Hep G2細胞的毒性及其作用機制,以期進一步豐富和完善MC-LR肝細胞毒性作用機制理論、解析MC-LR毒性作用的危害及評價MC-LR的環(huán)境安全風險,為研究MCs對人類健康的影響及其防護提供理論支撐。研究內容及獲得的主要實驗結果:(1)MC-LR對Hep G2細胞的毒性作用及其特點本研究首先通過MTT實驗檢測細胞活力、流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡、倒置熒光顯微鏡檢測細胞及細胞器形態(tài),評價MC-LR對Hep G2細胞的毒性作用及其特點。實驗結果顯示,0.1 n M-10μM MC-LR短時間暴露未對Hep G2細胞的活力、細胞周期和細胞凋亡產生明顯影響;而0.1-50 n M MC-LR處理Hep G2細胞96 h也未顯著改變細胞活力。高濃度MC-LR(20-100μM)暴露Hep G2細胞卻顯著抑制細胞活力,并呈時間-劑量-效應關系。用0.5-50μM MC-LR暴露Hep G2細胞,倒置熒光顯微鏡鏡檢發(fā)現,高濃度MC-LR暴露改變Hep G2細胞形態(tài)、導致細胞損傷。Hoechst 33342染色后檢測發(fā)現,一定濃度的MC-LR暴露導致細胞核損傷并誘導細胞凋亡。Acridine orange染色后檢測發(fā)現,高濃度MC-LR暴露對細胞溶酶體造成嚴重損傷,且呈時間-劑量依賴效應關系。Rhodamine-123染色檢測發(fā)現,較低濃度MC-LR暴露,部分Hep G2細胞線粒體出現輕微形態(tài)改變,但無明顯結構損傷;而高濃度MC-LR長時間暴露后,Hep G2細胞線粒體損傷明顯,且彌散性地分布在細胞內,這說明MC-LR暴露對Hep G2細胞的線粒體產生了損傷。該實驗結果表明,MC-LR對Hep G2細胞的毒性具有濃度依賴性,非細胞毒濃度染毒對細胞活力無影響,而高濃度處理可導致細胞凋亡。(2)MC-LR對Hep G2細胞代謝及其耐藥基因表達的影響由于0.1 n M-10μM MC-LR暴露Hep G2細胞24 h并未影響受試細胞的細胞活力、細胞周期和細胞凋亡。因此,我們首先要確定Hep G2細胞內是否表達MC-LR特異性轉運體—有機陰離子轉運多肽(OATP 1B1和OATP 1B3),并確定MC-LR是否真正進入到Hep G2細胞內。通過q PCR檢測發(fā)現,Hep G2細胞內確實存在OATP1B1和OATP 1B3基因的表達。而通過Western blot技術并使用MC-LR特異性抗體檢測,結果證實MC-LR可進入Hep G2細胞,且MC-LR處理濃度越高,檢測到細胞內MC-LR特異性條帶越強。MC-LR雖然可進入Hep G2細胞,但低濃度染毒并未對細胞表型產生影響。但進一步研究發(fā)現,MC-LR暴露引起Hep G2細胞I相和II相部分代謝酶及外排泵基因表達的改變,說明MC-LR染毒可能擾亂這些代謝酶的正常功能。因此推測Hep G2細胞代謝酶在MC-LR代謝和解毒過程中可能發(fā)揮作用。為了驗證該假設,接下來我們使用CYPs誘導劑Omeprazole(OME)、Ethanol(ETH)和Rifampicin(RIF)處理Hep G2細胞,提高代謝酶活性以證實Hep G2細胞內代謝酶是否在MC-LR的代謝過程中發(fā)揮作用。實驗結果顯示,用5μM MC-LR染毒后,CYPs誘導劑影響Hep G2細胞活力,其中ETH的誘導作用最明顯。由于ETH是CYP2E1特異性誘導劑,進一步通過CYP2E1抑制劑Chlormethiazole(CMZ)實驗證實,MC-LR可通過上調CYP2E1表達或酶活性而誘導產生過量的ROS,并對Hep G2細胞產生毒性、引起線粒體損傷而導致細胞凋亡。通過ROS清除劑L-抗壞血酸與MC-LR共培養(yǎng)細胞,結果發(fā)現ROS清除劑能減少MC-LR誘導產生ROS及其誘導的細胞死亡。(3)MC-LR低濃度長期暴露對Hep G2細胞的影響已有研究表明,低濃度MC-LR長期暴露能促進細胞增殖并誘發(fā)肝炎/肝癌。為探究該機理,本研究進一步選擇低濃度MC-LR(0.1-30 n M)暴露Hep G2細胞83 d。Western blot檢測結果顯示,即使極低濃度的MC-LR(0.1 n M)染毒后,該毒素也可有效地進入Hep G2細胞,但CCK-8檢測并未發(fā)現MC-LR對細胞活力產生明顯的影響。然而,通過DCF熒光分析結果顯示,30 n M MC-LR暴露Hep G2細胞使其ROS水平較對照組顯著上升;而5和10 n M MC-LR長時間暴露促進細胞SOD活性升高。該結果說明,低濃度MC-LR長時間暴露也能誘導細胞產生過量的ROS,而細胞內高活性SOD可能在清除過量ROS過程中發(fā)揮重要作用。采用0.1-30 n M MC-LR暴露Hep G2細胞48 h,對細胞NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平無明顯影響;而MC-LR長時間暴露卻顯著提升細胞內NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平。(4)高濃度MC-LR處理致Hep G2細胞凋亡及其機理細胞毒性實驗結果表明,高濃度MC-LR可通過誘導Hep G2細胞產生過量的ROS而對細胞產生毒性并導致細胞凋亡。為探究MC-LR誘導Hep G2細胞產生過量ROS導致細胞凋亡的信號途徑,我們用10-50μM MC-LR暴露Hep G2細胞,檢測后發(fā)現,Hep G2細胞內ROS水平上升、HSP70和HSP90表達增加、SOD和CAT活性降低、GSH含量降低,且較高濃度組與對照組差異顯著。另外,Hep G2細胞MDA水平明顯提高。該結果說明,高濃度MC-LR暴露誘導Hep G2細胞產生過量的ROS、引起細胞氧化應激,并導致細胞脂質過氧化程度加重。用0.5-50μM MC-LR暴露Hep G2細胞,通過Western blot和q PCR檢測發(fā)現,Hep G2細胞線粒體相關的COX-2、Cyt-c和Smac/Diablo的表達上調;p53 m RNA水平上調,并使其蛋白磷酸化水平明顯增強;p21/WAF1、Fas和Fas L表達水平普遍上調。MC-LR暴露還影響Hep G2細胞Bad、Cleaved-Bid、Bcl-2和Bax蛋白表達水平,促進Bax與Bcl-2表達。MC-LR暴露顯著促進Hep G2細胞PUMA蛋白表達;而30和50μM MC-LR處理6 h抑制細胞survivin表達,隨后多數濃度MC-LR處理組卻促進survivin表達。另外,0.5-50μM MC-LR暴露還促進細胞Caspase-3和Caspase-9 m RNA水平提升和酶活性升高,而高濃度MC-LR暴露也促進Caspase-8的表達。本研究還發(fā)現,Hep G2細胞c-myc m RNA變化與MC-LR暴露濃度和時間有關,且MC-LR能促進c-Myc蛋白表達,高濃度MC-LR暴露24 h能增強Hep G2細胞c-Myc(phosphor S62)磷酸化水平。MC-LR暴露促進Hep G2細胞c-fos和c-jun轉錄和蛋白水平提升,說明MC-LR可能引起細胞DNA損傷并誘發(fā)遺傳毒性,而c-myc、c-fos和c-jun可能在MC-LR促進腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。(5)MC-LR肝細胞毒性的轉錄組學分析為進一步全面和系統(tǒng)地研究MC-LR細胞毒性的作用機制,本實驗通過轉錄組學方法研究了不同濃度MC-LR暴露對Hep G2細胞轉錄組的影響。結果顯示,0.5、5、10、和50μM MC-LR處理組Hep G2細胞與對照組細胞相比分別有532、32、30和984個基因發(fā)生極顯著變化。通過GO分析發(fā)現,低濃度MC-LR(0.5μM)暴露影響Hep G2細胞的遷移、運動、細胞定位、細胞組分移動、磷酸化調節(jié)和磷酸鹽代謝過程調節(jié)。而高濃度MC-LR(50μM)暴露影響Hep G2細胞差異表達基因顯著富集到94個亞類,如細胞代謝調節(jié)、細胞生物合成調節(jié)、基因表達調控、磷酸化調節(jié)、激酶活性調節(jié)、免疫系統(tǒng)、MAPKKK通路調節(jié)、細胞增殖、分化、遷移、細胞運動、細胞壞死和細胞凋亡等。KEGG pathway分析結果顯示,MC-LR暴露影響Hep G2細胞磷酸肌醇代謝、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、NF-κB信號通路、p53信號通路和MAPK信號通路等重要信號通路。(6)MC-LR處理對Hep G2細胞mi RNA表達譜的影響雖然目前MCs毒性機理已有較多研究,但micro RNA(mi RNA)是否在MCs毒性過程發(fā)揮作用卻報道甚少。本實驗用不同濃度的MC-LR暴露Hep G2細胞后,通過高通量測序檢測受試細胞mi RNA表達譜。實驗結果顯示,10μM MC-LR暴露顯著改變Hep G2細胞mi RNA表達,其中5個上調、16個下調,共預測到37 566個靶基因;而50μM MC-LR處理組Hep G2細胞mi RNA表達顯著上調的有20個、表達下調17個,共預測到39 174個靶基因。與對照組相比,10μM和50μM MC-LR處理組均引起Hep G2細胞has-mi R-149-3p、has-mi R-449c-5p和has-mi R-454-3p表達顯著上調,引起has-mi R-4286、has-mi R-500a-3p、has-mi R-500a-5p和has-mi R-500b-5p表達顯著下調。q PCR檢測結果也驗證了以上結果。MC-LR暴露Hep G2細胞引起差異表達mi RNA的靶基因共篩選出23個顯著富集的GO條目,其中有3個在10μM和50μM MC-LR暴露組均顯著富集。而KEGG pathway分析結果顯示,MAPK信號通路、次生代謝產物的合成、嘧啶代謝和嘌呤代謝等信號通路可能在MC-LR對Hep G2細胞的毒作用過程中通過mi RNA負調節(jié)發(fā)揮作用。通過mi RNA表達譜分析還從Hep G2細胞中預測并篩選出了110個候選新mi RNA,進一步豐富了人類mi RNA數據庫資源,并為后續(xù)的功能分析研究提供了基礎支撐。本研究的主要結論:(1)MC-LR的暴露濃度及作用時間影響其對Hep G2細胞的毒性,而高濃度MC-LR處理可導致Hep G2細胞凋亡,且線粒體和溶酶體與該過程可能密切相關。(2)MC-LR可通過上調Hep G2細胞CYP2E1表達或酶活性而誘導細胞產生過量的ROS并對細胞產生毒性。(3)低濃度MC-LR長時間暴露可能會促發(fā)細胞的炎性反應。(4)高濃度MC-LR可通過誘導Hep G2細胞產生過量的ROS、激活線粒體細胞凋亡信號途徑而介導細胞凋亡,PUMA和survivin在其中可能發(fā)揮重要作用。(5)高濃度MC-LR暴露也會激活Fas/Fas L死亡受體通路,并介導細胞凋亡。(6)MC-LR的肝細胞毒性作用由多種基因和蛋白參與、并由多條信號通路協同或拮抗而發(fā)揮作用。(7)mi RNA可能與MC-LR肝細胞毒性及其誘發(fā)的肝炎、肝癌有關,并可能在其中扮演重要的調控角色。本研究結果有助于從毒理學和分子水平揭示MC-LR導致易感人群患肝炎/肝癌的原因,為MC-LR安全風險評價和人類健康防護提供了理論支撐。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河南師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R99
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本文編號：1545112