本文關鍵詞： NEP 畢赤酵母表達 抑制劑 高通量篩選　出處：《中國生物工程雜志》2015年02期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的:建立以蛋白酶Neprilysin(NEP)為靶點的高通量藥物篩選模型,應用該模型篩選抑制劑。方法:利用畢赤酵母表達系統(tǒng)。構建重組質粒p PICZα-A-NEP,表達載體通過與酵母菌X-33基因組染色體發(fā)生同源重組,將外源基因整合于染色體后實現(xiàn)目的蛋白的表達。應用熒光共振能量轉移法(FRET)檢測蛋白酶活性,優(yōu)化反應條件,建立藥物篩選體系,篩選抑制劑。結果:成功構建表達載體p PICZα-A-NEP;建立了以NEP為靶標的藥物篩選模型,獲得模型反應動力學參數(shù)Vmax=3.6μM/s,Kcat/Km=4.5×105M-1s-1,測定模型Z-因子為0.89,說明體系穩(wěn)定可用于以NEP為靶標的藥物的高通量篩選;并用該模型對天然產(chǎn)物組分庫進行篩選,在0.5mg/ml的藥物濃度下,得到抑制率較高的藥物為4種,并測得半數(shù)抑制濃度IC50值,其中MDCNCL01000242的IC50值最低,為(8.31±0.03)μg/ml。結論:建立的藥物篩選模型較為理想,適用于NEP抑制劑的篩選,可促進藥物的研發(fā)。
[Abstract]:Objective: to establish a high-throughput drug screening model targeting the protease Neprilysin nep. Methods: the recombinant plasmid p PICZ 偽 -A-NEP was constructed by using Pichia pastoris expression system. The expression vector was homologous recombined with the genome chromosome of yeast X-33. The expression of the target protein was realized by integrating the exogenous gene into the chromosome. The protease activity was detected by fluorescence resonance energy transfer method, the reaction conditions were optimized, and the drug screening system was established. Results: the expression vector p PICZ 偽 -A-NEP was successfully constructed, and a drug screening model targeting NEP was established. The kinetic parameters of the model reaction were obtained: Vmax=3.6 渭 M / s / Kcat / KMT 4.5 脳 105M-1s-1, and the model Z- factor was 0.89, which indicated that the system was stable and could be used for the high-throughput screening of drugs targeting NEP, and the natural product component library was screened by the model at the concentration of 0.5mg / ml. Four kinds of drugs with high inhibition rate were obtained, and half inhibitory concentration (IC50) was measured. The IC50 value of MDCNCL01000242 was the lowest (8.31 鹵0.03) 渭 g / ml. Conclusion: the established drug screening model is ideal and suitable for the screening of NEP inhibitors and can promote the development of drugs.
【作者單位】： 天津科技大學生物工程學院;天津市國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院;旭和(天津)醫(yī)藥科技有限公司;南開大學藥學院;
【基金】：國家自然科學基金(81102374) 天津市科技支撐計劃(13ZCZDSY03300) 天津市科技計劃(13ZCZDSY02600)資助項目
【分類號】：R96

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本文編號：1539770