發(fā)布時間：2018-02-26 04:17

  本文關(guān)鍵詞： 杜興肌肉萎縮癥 肽核酸 抗肌萎縮蛋白 外顯子跳讀 反義寡核苷酸　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：杜興肌肉萎縮癥(Duchenne Muscular Dystrophy-DMD)是一種X染色體連鎖遺傳的肌肉退行性遺傳病,由抗肌萎縮蛋白dystrophin基因發(fā)生突變引起dystrophin蛋白缺失所致,目前臨床尚無有效的治療方法。反義寡核苷酸(Antisens Oligonucleotides,AOs)介導(dǎo)的外顯子跳讀在DMD的治療研究方面顯示出了巨大的潛力,已有兩種反義寡核苷酸藥物(2'Ome RNA和PMO)在III期臨床試驗(yàn)。然而,最近2'Ome RNA臨床試驗(yàn)未能達(dá)到預(yù)期的治療效果;同樣PMO也低于預(yù)期結(jié)果。因此,新型反義寡核苷酸藥物的探索和研發(fā)對DMD疾病治療具有非常重要的意義。肽核酸(Peptide Nucleic Acid,PNA)是一種新型、人工合成的化學(xué)結(jié)構(gòu),具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、與核酸的結(jié)合力強(qiáng)、特異性高等特點(diǎn)。在前期工作中,我們已在DMD小鼠(mdx)模型上,通過局部肌肉注射,初步展示了PNA介導(dǎo)外顯子跳讀的潛力。在本研究中,我們通過優(yōu)化不同長度PNA的生物活性,獲得最佳候選長度PNA20作為系統(tǒng)測試的藥物,并進(jìn)一步對PNA20給藥方案進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示:在高劑量重復(fù)給藥條件下,PNA20能夠高效地介導(dǎo)外顯子跳讀和dystrophin蛋白恢復(fù)表達(dá),并能夠部分恢復(fù)mdx小鼠的的肌肉功能;同時在系統(tǒng)測試中,未檢測到任何藥物相關(guān)的毒副作用,充分展示了PNA作為一種新型反義寡核苷酸候選藥物,在DMD疾病外顯子跳讀療法中的應(yīng)用潛力。方法:1.不同長度PNA在mdx小鼠上的局部測試。設(shè)計不同長度的PNA并在杜興肌肉萎縮癥動物模型mdx小鼠上進(jìn)行局部測試。在前脛骨肌(Tibialis anterior muscle,TA)上分別注射PNA20(+2-18)、PNA25(+7-18)、PNA26(+10-16)、PNA28(+7-21)和PNA30(+14-16),兩周后收樣,通過免疫組化分析、RT-PCR和Western blot方法檢測不同長度PNA介導(dǎo)外顯子23跳讀效率及dystrophin蛋白恢復(fù)表達(dá)的水平。2.候選PNA在mdx小鼠上的系統(tǒng)測試。利用上步優(yōu)化所得的候選PNA,系統(tǒng)測試PNA25和PNA30介導(dǎo)dystrophin基因外顯子23跳讀效率及蛋白恢復(fù)的能力。按照25mg/kg的劑量,以尾靜脈注射的方法注射到mdx小鼠體內(nèi),每周注射1次,連續(xù)注射3次,注射結(jié)束四周后收集各部位肌肉組織樣品,并通過免疫組化、RT-PCR等方法檢測其誘導(dǎo)外顯子23跳讀效率和dystrophin蛋白的表達(dá)水平。3.酸性對PNA溶解性及活性影響的測試。用0.1M的Na OH調(diào)節(jié)PNA25的p H值分別為p H=2,3,4,5,6,7,用超微量核酸蛋白測定儀檢測其濃度。將p H=5-6以及p H=2-3的PNA藥物按照5μg/TA的劑量進(jìn)行局部測試,注射完兩周后收樣。通過免疫組化檢測dystrophin蛋白的恢復(fù)表達(dá)的水平。將p H1,p H=2-3,p H=4-5三組PNA藥物按50mg/kg的劑量通過尾靜脈的方法分別注到mdx小鼠體內(nèi),每周注射1次,連續(xù)注射3次。注射完四周后,收集全身肌肉組織樣品,通過免疫組化及RT-PCR的方法檢測其活性。4.優(yōu)化不同長度PNA的系統(tǒng)活性。將PNA25和PNA20按50mg/kg的劑量分別通過尾靜脈注射的方法注射到mdx小鼠體內(nèi),每周注射1次,連續(xù)注射3次。注射完四周后,收集全身肌肉組織樣品,通過免疫組化、RT-PCR等檢測其誘導(dǎo)外顯子23跳讀的效率和dystrophin蛋白的表達(dá)水平。本研究進(jìn)一步比較了PNA20和PNA18在100mg/kg,連續(xù)注射3次的給藥劑量下,二者誘導(dǎo)外顯子23跳讀效率及dystrophin蛋白恢復(fù)表達(dá)的情況。為進(jìn)一步評估PNA20效力,本研究比較了PNA20和PMO在50mg/kg劑量下,連續(xù)3次注射,二者在mdx小鼠上介導(dǎo)外顯子23跳讀效率及dystrophin蛋白恢復(fù)表達(dá)的水平。5.高劑量PNA20系統(tǒng)活性測試。將PNA20分別按100mg/kg單次注射、3次連續(xù)注射和5次連續(xù)注射,每周1次的給藥方案,通過尾靜脈注射mdx小鼠,最后一次注射后四周,收集全身肌肉組織樣品及肝、腎臟等組織,通過免疫組化、RT-PCR和Western blot等檢測其誘導(dǎo)外顯子23跳讀的效率和dystrophin蛋白的表達(dá)水平。進(jìn)一步對PNA20治療mdx小鼠進(jìn)行功能學(xué)評價,包括抓力測試(grip strength)、dystrophin蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合體(DAPC)的恢復(fù)表達(dá)情況、血清肌酸激酶(CK)等指標(biāo)。通過HE染色方法對治療組mdx小鼠肝臟,腎臟進(jìn)行病理學(xué)檢測、通過檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT),谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平判斷損傷情況、利用免疫組化法檢測肌肉炎癥細(xì)胞CD3、CD68分布情況,從而對PNA20系統(tǒng)毒副作用進(jìn)行評估。結(jié)果:1.不同長度PNA在mdx小鼠局部優(yōu)化測試結(jié)果顯示:PNA20、PNA25和PNA30介導(dǎo)外顯子跳讀效率和dystrophin蛋白的表達(dá)水平較其他檢測的PNA高,且差異顯著,提示PNA20、PNA25和PNA30可以作為后續(xù)系統(tǒng)測試的候選藥物。2.通過比較候選PNA25和PNA30系統(tǒng)注射后,mdx小鼠肌肉組織中dystrophin蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示PNA30治療組中陽性肌纖維數(shù)要略多于PNA25治療組,但二者無顯著性差異。同時,兩個治療組在心肌中均未檢測到dystrophin陽性肌纖維表達(dá)。3.不同p H值條件下PNA的活性測試結(jié)果顯示:PNA溶液在p H值為2-3時,PNA溶解度較高且活性最高,局部和系統(tǒng)測試結(jié)果均證明這一結(jié)果。4.PNA25和PNA20的系統(tǒng)活性測試結(jié)果顯示:在同等劑量下,PNA20與PNA25在介導(dǎo)外顯子跳讀及恢復(fù)dystrophin蛋白表達(dá)的活性相當(dāng),但PNA20具有更高的安全性和溶解度,二者介導(dǎo)dystrophin蛋白表達(dá)和外顯子跳讀的整體水平均未達(dá)到治療水平。進(jìn)一步與PNA18在100mg/kg,連續(xù)3次注射的系統(tǒng)注射效果比較顯示:提高劑量后,PNA20治療組中dystrophin陽性肌纖維數(shù)量、外顯子23跳讀效率和dystrophin蛋白表達(dá)水平均高于PNA18治療組,顯示PNA20作為DMD候選藥物的潛力。5.對PNA20系統(tǒng)、全面的活性及給藥方案優(yōu)化測試結(jié)果顯示:PNA20表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng),在100mg/kg劑量下,5次重復(fù)注射治療組dystrophin陽性肌纖維數(shù)、外顯子23跳讀效率和dystrophin蛋白表達(dá)水平與單次及三次重復(fù)注射相比,均表現(xiàn)出顯著提高。在5次重復(fù)注射治療組中,在股四頭肌及腓腸肌中dystrophin蛋白表達(dá)水平接近40%正常水平。進(jìn)一步功能測試結(jié)果表明:在5次重復(fù)給藥后,治療組mdx小鼠的各項(xiàng)功能指標(biāo)顯著改善,包括抓力水平顯著提高、DAPC恢復(fù)正常定位、血清中CK值顯著下降等,說明5次重復(fù)注射能夠顯著恢復(fù)mdx小鼠的功能。對PNA20在高劑量重復(fù)注射的條件下的毒性測試,未發(fā)現(xiàn)明顯的藥物相關(guān)毒副作用及免疫反應(yīng)。結(jié)論:1.通過對不同長度PNA的局部活性優(yōu)化,結(jié)果表明:PNA表現(xiàn)出明顯的長度依賴型效應(yīng),即隨PNA長度增加,其活性增加,其中PNA30活性最高,其次為PNA25和PNA20。2.在對不同長度PNA在mdx小鼠上的系統(tǒng)活性測試中,發(fā)現(xiàn)隨PNA長度增加,其溶液酸性逐漸變強(qiáng),PNA30PNA25PNA20。PNA溶液的酸性導(dǎo)致較長PNA不適合在mdx小鼠上的系統(tǒng)測試。其酸性來源于PNA純化過程中的三氟乙酸。因此,盡管PNA30活性略優(yōu)于PNA20和PNA25,但基于目前PNA的純化工藝,PNA20為活性和安全性的最佳組合長度。同時,我們的研究發(fā)現(xiàn):PNA在不同酸性條件下,其溶解度及生物活性差異較大;在p H值為2-3時,PNA的生物學(xué)活性最高。3.對PNA20給藥方案的優(yōu)化及系統(tǒng)測試研究,顯示在劑量為100mg/kg,多次重復(fù)給藥的條件下,PNA20能夠有效地介導(dǎo)外顯子跳讀和誘導(dǎo)dystrophin蛋白恢復(fù)表達(dá)。在100 mg/kg劑量,5次重復(fù)注射,能夠誘導(dǎo)約40%正常水平的dystrophin蛋白表達(dá),并有效地恢復(fù)治療組mdx小鼠的肌肉功能。尤為重要的是,相關(guān)藥物毒性測試結(jié)果顯示:在高劑量重復(fù)給藥的條件下,未檢測到任何毒性及免疫反應(yīng)發(fā)生,提示PNA20是安全有效的候選藥物,為DMD疾病的臨床治療提供了一種有效的候選藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96

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