本文關(guān)鍵詞： 高通量 未純化融合酶 比活性 最大吸附量 測定　出處：《重慶醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：6-His標簽與酶及其突變體融合表達后，可用ELISA原理或磁分離原理在固定親和分離介質(zhì)的量的基礎(chǔ)上，通過預測親和分離介質(zhì)對融合酶的最大吸附量推算比活性等效量Vs，高通量定量比較酶及其突變體的比活性。該方法能夠有效地克服克隆接種量、誘導表達效率、細胞裂解效率等的差異對裂解液中融合酶比活性的影響，盡量避免了假陽性突變體的出現(xiàn)。更關(guān)鍵的是，可以應用于定量測定細胞裂解液中的未純化標簽融合酶及其突變體的比活性，更有效的避開融合酶在純化過程面臨的技術(shù)、成本和勞動挑戰(zhàn)，為酶突變體庫的高通量篩選提供了快速、高效的方法。該方法建立需一個適合比活性的融合酶或突變體作為突變體設計的起始酶；一組適合的標簽與親和分離介質(zhì)作為吸附分離實驗的基礎(chǔ)。本文首先建立定量測定細胞裂解液中未純化融合酶及其突變體比活性的新方法。 1.高通量定量比較細胞裂解液中未純化融合酶比活性方法的建立 在測定室中的實驗，利用的是親和分離介質(zhì)與細胞裂解液中的肽標簽融合酶或其突變體所帶標簽的特異性結(jié)合。固定測定室中親和分離介質(zhì)的量，則每個測定室所能結(jié)合的最大蛋白量是與親和分離介質(zhì)對標簽結(jié)合容量直接相關(guān)的數(shù)據(jù)。理論上，相同的親和介質(zhì)、相同的包被量，測定室中所能結(jié)合的肽標簽量是相同即最大吸附量N，此時所測定出不同酶的活性Vs則是用來比較比活性最有價值的數(shù)據(jù)。當吸附結(jié)合量達到N時，即使不斷增大測定室的蛋白量，反應速度V也不會再繼續(xù)在增大，這時候測定室反應速度即是該酶的最大比活性（Vs）。但是，在實際操作中，要達到親和介質(zhì)吸附的飽和化，，除需要較大的蛋白量外，還會帶來在活性測定中出現(xiàn)的反應速度過快的弊端。為解決這一點，通過跟蹤吸附結(jié)合后的反應速度（V）與測定室中結(jié)合蛋白量--Quantity of Protein（μg）的響應曲線用雙倒數(shù)法或是Matlab曲線擬合的方式來預測融合酶在測定室中的最大吸附容量（N）從而定量計算其比活性(Vs)。實驗過程中根據(jù)ELISA原理與磁分離技術(shù)，我們可以同時對多個突變體的多個測定室進行實驗操作，實現(xiàn)高通量模式下的比較。基于肽標簽與親和分離介質(zhì)的可逆結(jié)合，建立對該可逆結(jié)合平衡的化學計量學新的分析方法。該方法不需要肽標簽融合酶及其突變體的純樣品，其過程本身就是對加入測定室的樣品的純化、分離，最終測定的反應速度Vs即是純酶的比活性，這為細胞裂解液中的未純化融合酶活性的比較提供了一種新的行之有效的方法。 2.預測和定量比較6-His-羧酸酯酶及其突變體的比活性：mcAb為親和分離介質(zhì) 通過基因全合成及突變體的構(gòu)建得到一組融合6-His標簽的羧酸酯酶及其突變體M326L，并以mcAb作為固定用親和分離介質(zhì)，利用ELISA原理，在高通量模式下對融合酶及其突變體進行誘導表達、蛋白濃度和表觀比活性的測定，并應用本方法對融合酶及其突變體的細胞裂解液進行定量活性比較。通過雙倒數(shù)曲線預測Vs得到Est1與M326L的相對比活性值為3.0±0.2，CV≤10%（n≥5），對比多批次誘導表達以及Matlab的正態(tài)性分析，得到二者的活性比值：在250ml與4ml培養(yǎng)基中分別為3.0±0.5，CV≥18%（n1=25，n2=11）和3.2±1.3，CV≥40%（n1=122,n2=35）。該應用中，抗體的用量為0.6μg即可滿足要求，雖然其選擇性較高，但親和力不足，蛋白的用量甚至需要達到200μg以上，才能較準確的預測和比較，因此用于酶突變體庫的的初篩收到樣品量和成本的限制。當然，本方法樣品為細胞裂解液上清，在準確性相對提高的同時，又使得比活性的測定不需要通過蛋白純化這種復雜的過程，尤其適用于酶穩(wěn)定性隨溫度、表面活性劑、金屬離子等敏感改變的酶。即使同一酶的不同細胞裂解液由于其他因素導致的表觀比活性差異可達到5倍以上時，只要在吸附分離過程中使得數(shù)據(jù)滿足：Vmin≥0.090，Vmax≤1.800；最低稀釋濃度點的抗體結(jié)合率在40%以上，本方法亦可有效預測Vs且CV值在10%以下，雙倒數(shù)曲線的相關(guān)系數(shù)R2≥0.95。 3.預測和定量比較6His-大腸桿菌堿性磷酸酶及其突變體的比活性：Ni-NTA為親和分離介質(zhì) 在以ECAP與R167K作為應用模型試驗中，仍以6-His標簽與酶及其突變體融合表達。ECAP與R167K用Ni-NTA純化后獲得較好的純化效果，能相對準確得測得二者比活性的相對值為1.75±0.08CV≤5%(n=3)；采用本文建立的方法，用Matlab曲線擬合的方式預測Vs并得到ECAP與R167K的相對比活性值為1.73±0.14，CV≤10%(n=3)，R2≥95%，與純化后所得標簽融合酶及其突變體的比活性比值僅相差不到3%，比較通過多批次誘導表達得到二者的活性比值：在4ml培養(yǎng)基條件下為1.2±0.3，且CV≥20%（n1=n2=13）。進一步說明本方法在定量比較細胞裂解液中未純化標簽融合酶及其突變體的比活性方面的意義。該應用中使用親和分離介質(zhì)是Ni-NTA磁珠，我們可以根據(jù)酶比活性的高低，通過調(diào)整EP管中參與吸附分離反應的Ni-NTA磁珠的量以及酶促反應時間來控制反應速度。使用Ni-NTA磁珠量為25μg時，總蛋白上樣量在1μg至20μg左右即可有效預測其在EP管中的最大吸附量（N），避免了雜蛋白對吸附分離的影響，當表達豐度P≥3%的時候，該方法便準確預測和測定酶的比活性Vs。當然要注意的一點就是：雙倒數(shù)曲線應用的條件是測定室中融合酶或其突變體的總量n應是該測定室親和分離介質(zhì)的最大吸附量N的20倍或以上。由于在該應用中所使用的蛋白量很低，因此不滿足雙倒數(shù)法進行數(shù)據(jù)的分析的要求，取而代之的是Matlab的曲線擬合方法，仍是具有重要意義的。由于Ni-NTA磁珠的親和力較mcAb高得多，但選擇行卻不及mcAb，故在實驗操作過程中，蛋白質(zhì)的用量更需要精心的控制。就整個操作而言，Ni-NTA磁珠的吸附分離反應更適用于突變體的確認，卻不適合于突變體庫的初篩。以Ni-NTA為親和分離介質(zhì)時整個實驗操作過程僅為2h較mcAb的26h的耗時過程，大大降低實驗耗時，即使對溫度比較敏感的酶，也可得到較好地應用，因此更具有優(yōu)勢。 該方法應用于突變體庫的建立及高通量篩查中的關(guān)鍵是設計適合活性的肽標簽融合酶作為突變體庫建立的起始酶。根據(jù)酶活性的高低選擇合適的親和介質(zhì)固定量、樣品蛋白的稀釋度、適宜的反應時間都顯得極為重要。應用中能夠有效地克服克隆接種量、誘導表達效率、細胞裂解效率等的差異對裂解液中肽標簽融合酶比活性的影響，盡量避免了假陽性突變體的出現(xiàn)，并且能夠在高通量模式下進行，為獲得高活性突變體以及酶突變體庫的建立與篩選提供了快速、高效、準確的方法。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【參考文獻】

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