本文關(guān)鍵詞： 橘青霉 llm3 美伐他汀 無性繁殖 次級代謝　出處：《西南大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:絲狀真菌是天然產(chǎn)物的寶庫,從絲狀真菌中分離的次級代謝產(chǎn)物大約有1500多種,一半以上的次級代謝產(chǎn)物都具有抗菌,抗腫瘤等活性。青霉素、環(huán)孢菌素、頭孢菌素、辛伐他汀、多柔比星、阿維霉素等藥物均來自絲狀真菌。近年來研究表明,絲狀真菌基因組中大量次級代謝基因簇處于沉默狀態(tài)。在絲狀真菌中,次級代謝基因簇的轉(zhuǎn)錄和翻譯受到多種因子的調(diào)控,如全局性調(diào)控因子LaeA、途徑特異性調(diào)控因子(含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子)和表觀遺傳等。他們共同調(diào)控絲狀真菌生長發(fā)育和次級代謝基因簇的表達。全局性調(diào)控因子LaeA是2004年在構(gòu)巢曲霉中發(fā)現(xiàn),它含有保守的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合位點,且該保守位點和絲狀真菌生長發(fā)育密切相關(guān),可以促進基因簇的轉(zhuǎn)錄和翻譯,從而調(diào)節(jié)絲狀真菌次級代謝產(chǎn)物的合成。2008年在構(gòu)巢曲霉中發(fā)現(xiàn)LaeA可以和VeA/VelB在細胞核內(nèi)形成蛋白三聚體,調(diào)節(jié)構(gòu)巢曲霉的生長發(fā)育和次級代謝。2013年,在構(gòu)巢曲霉中,發(fā)現(xiàn)了LaeA同源的甲基轉(zhuǎn)移酶LlmF,位于細胞質(zhì)中,也可以和VeA/VelB在細胞質(zhì)中形成三聚體,調(diào)節(jié)次級代謝和生長發(fā)育。LaeA和Lae A類似的甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白成為研究熱點,研究方向更多的集中在甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白Llm調(diào)控絲狀真菌的全局網(wǎng)絡(luò)。橘青霉是美伐他汀產(chǎn)生菌,目前對于橘青霉次級代謝和生長發(fā)育的研究還比較少,基因組數(shù)據(jù)分析顯示橘青霉中存在大量未知的次級代謝基因簇,其合成次級代謝的潛力還未被充分挖掘。本課題組已經(jīng)報道了全局性調(diào)控因子LaeA、VeA正向調(diào)節(jié)橘青霉美伐他汀的生物合成,基因組測序獲得橘青霉基因組序列框架圖,但是在橘青霉中是否存在其他的甲基轉(zhuǎn)移酶以及這些蛋白是否參與橘青霉次級代謝和生長發(fā)育的調(diào)節(jié)還未見報道。本課題在獲得橘青霉基因組框架圖的基礎(chǔ)上,分析橘青霉基因組中潛在的甲基轉(zhuǎn)移酶,成功獲得9個含有adomet_mtases結(jié)構(gòu)域的蛋白,并重點分析了llm3的功能。通過農(nóng)桿菌和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法獲得了橘青霉llm3過表達和敲除菌株,探索llm3對橘青霉生長發(fā)育和次級代謝合成的影響。目的:利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化構(gòu)建了橘青霉llm3過表達菌株(oe::llm3菌株)和llm3敲除菌株(Δllm3菌株),分析橘青霉oe::llm3菌株、Δllm3菌株和wt菌株之間菌落菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)量、美伐他汀產(chǎn)量等的差異,探究橘青霉中l(wèi)lm3對次級代謝和生長發(fā)育的影響。方法:1.提取橘青霉基因組,利用illuminahiseq測序技術(shù),獲得橘青霉基因組框架圖;2.通過本地blast獲得橘青霉中含有adomet-mtases結(jié)構(gòu)域的蛋白,用進化樹分析各蛋白之間同源關(guān)系,用rt-pcr獲得橘青霉llm3的cdna序列,分析llm3蛋白質(zhì)序列中的保守位點;3.在pyeu和pgihtgi載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建敲除和過表達載體,所構(gòu)建載體利用酶切和測序進行驗證。將驗證好的過表達質(zhì)粒pgihtgi-llm3轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌lba4404中,通過潮霉素抗性篩選和pcr驗證獲得橘青霉llm3過表達菌株。利用原生質(zhì)體將pyeu質(zhì)粒中6.1kb的敲除片段轉(zhuǎn)入橘青霉中,利用潮霉素抗性初篩和pcr驗證獲得敲除敲除菌株;4.通過菌落培養(yǎng)、顯微鏡觀察和血球計數(shù)板計數(shù)分析wt菌株、oe::llm3菌株和Δllm3菌株在黑暗條件下的菌絲、菌落和孢子產(chǎn)量差異。利用rt-qpcr技術(shù)分析三株菌中孢子形成關(guān)鍵基因abaa和brla的轉(zhuǎn)錄差異;5.在pga培養(yǎng)基中發(fā)酵wt菌株、oe::llm3菌株和Δllm3菌株,通過hplc檢測三株菌的美伐他汀產(chǎn)量,利用rt-qpcr技術(shù)分析美伐他汀合成基因簇中mlcr、mlcb的轉(zhuǎn)錄差異。結(jié)果:1.橘青霉基因組大小為31.34mb,一共有716個contigs;2.通過橘青霉本地blast,成功鑒定了橘青霉中9個甲基轉(zhuǎn)移酶,生物信息學(xué)分析llm3的結(jié)構(gòu)和功能;3.成功獲得了oe::llm3和Δllm3菌株。4.llm3抑制橘青霉的無性繁殖。oe::llm3菌株的菌落顏色較淺,Δllm3菌株菌落顏色較深,oe::llm3菌株孢子產(chǎn)量較wt菌株少,而Δllm3菌株孢子產(chǎn)量較wt菌株多。oe::llm3菌株中分生孢子發(fā)育相關(guān)基因abaa和brla的表達量明顯降低,Δllm3菌株中分生孢子發(fā)育相關(guān)基因abaA和brlA的表達量顯著提高。5.llm3調(diào)控美伐他汀生物合成。在發(fā)酵第四天,WT菌株美伐他汀產(chǎn)量達到最大值,隨后美伐他汀產(chǎn)量下降。而過表達llm3后,美伐他汀產(chǎn)量從第四天開始增加,且持續(xù)積累,一直到第八天,產(chǎn)量還處于上升趨勢,llm3敲除后,美伐他汀產(chǎn)量和野生型趨勢相似,但是比野生型低。結(jié)論:在橘青霉中,llm3參與調(diào)節(jié)橘青霉的生長發(fā)育和次級代謝,llm3抑制橘青霉無性發(fā)育過程,且正向調(diào)控美伐他汀生物合成。一方面,Llm3通過抑制分生孢子合成途徑關(guān)鍵基因abaA和brlA的轉(zhuǎn)錄,從而抑制分生孢子的形成;另一方面,Llm3通過激活美伐他汀合成基因簇調(diào)控基因mlcR的轉(zhuǎn)錄促進合成基因的轉(zhuǎn)錄和表達。橘青霉中新的全局調(diào)控因子llm3對橘青霉生長發(fā)育和美伐他汀生物合成的研究有助于豐富橘青霉復(fù)雜的次級代謝調(diào)控途徑及其機制的闡明。
[Abstract]:In this study , we found that LaeA and VeA / VelB can be used to regulate the growth and development of filamentous fungi . The effects of llm3 on secondary metabolism and growth and development of Penicillium citrinum were studied by means of reverse transcription polymerase chain reaction ( RT - PCR ) . Conclusion : In Penicillium citrinum , llm3 is involved in the regulation of growth and secondary metabolism of Penicillium citrinum , llm 3 inhibits the development of Penicillium citrinum and regulates the biosynthesis of mevastatin . On the one hand , Llm3 inhibits the formation of conidium by inhibiting the transcription of genes abaA and brlA .

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R915

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本文編號：1516818