本文關(guān)鍵詞： CcrA酶 頭孢他啶 頭孢噻肟 分子識(shí)別 相互作用　出處：《西北大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)使得臨床上使用的多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素失效,這主要是因?yàn)槠淇梢援a(chǎn)生一種水解抗生素的金屬β-內(nèi)酰胺酶,脆弱擬桿菌產(chǎn)生的金屬β-內(nèi)酰胺酶CcrA是一種典型的金屬酶,但目前對(duì)其與該類抗生素之間的結(jié)合過程研究比較少,對(duì)此,本研究采用實(shí)驗(yàn)測定和理論預(yù)測相結(jié)合的方法,進(jìn)行對(duì)金屬β-內(nèi)酰胺酶CcrA與頭孢噻肟(CTX)和頭孢他啶(CAZ)之間分子識(shí)別和相互作用機(jī)理的研究,主要內(nèi)容如下:1.在大腸桿菌中對(duì)金屬β-內(nèi)酰酶CcrA進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),通過鎳離子親和層析法實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的分離純化,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定,最后通過Bradford法測定蛋白的含量。結(jié)果表明,該過程實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的蛋白CcrA的高效表達(dá),且純化后CcrA酶的純度較高,蛋白含量為0.26-0.28 mg/mL。2.利用熒光光譜法對(duì)CcrA酶與兩種頭孢菌素類抗生素(CTX和CAZ)之間的分子識(shí)別和相互作用進(jìn)行研究。測定了三個(gè)溫度下(277K、281K、285K)抗生素和CcrA酶相互作用的熒光光譜,獲得了二者結(jié)合過程中的熒光猝滅常數(shù)Ksv和猝滅速率常數(shù)Kq、結(jié)合常數(shù)Ka、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n以及結(jié)合過程中的熱力學(xué)參數(shù)等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兩種抗生素與CcrA酶之間發(fā)生的猝滅均為靜態(tài)猝滅;在相同溫度下,CcrA酶與CTX結(jié)合體系的Ksv和Kq均大于CcrA酶與CAZ結(jié)合體系,且CcrA酶與CTX結(jié)合體系的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n也比較大,這表明CcrA酶與CTX的結(jié)合能力大于CcrA酶與CAZ,同時(shí)也表明,結(jié)合過程生成的CcrA-CTX復(fù)合物穩(wěn)定性比較高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出,CcrA酶與兩種抗生素在結(jié)合過程中的吉布斯自由能、焓變等均為負(fù)值,表明CcrA酶與CTX、CAZ之間的相互作用是一個(gè)自發(fā)、放熱的過程。3.通過分子對(duì)接模擬方法研究了在CcrA酶與CTX、CAZ之間相互識(shí)別和作用過程中,酶分子內(nèi)氨基酸殘基和小分子配體中官能團(tuán)的相互作用模式。分析發(fā)現(xiàn)位于酶分子活性口袋附近的loop環(huán)柔性變化較大,表明二者在相互作用過程中,誘導(dǎo)契合效應(yīng)使得抗生素進(jìn)入酶分子活性口袋,loop環(huán)的柔性變化更有利于酶分子與抗生素結(jié)合,同時(shí)也佐證了以上實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論。兩個(gè)結(jié)合體系對(duì)接結(jié)果得到的吉布斯自由能變均為負(fù)值,表明CcrA酶與兩種抗生素之間的結(jié)合過程均可以自發(fā)進(jìn)行,與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。
[Abstract]:The emergence of superbacteria invalidates most of the 尾-lactams used in clinical use, mainly because they produce a metallo- 尾-lactamase, a hydrolytic antibiotic. Metallo-beta-lactamase (CcrA) produced by Bacteroides fragilis is a typical metalloenzyme, but its binding process with this kind of antibiotics is less studied at present. The molecular recognition and interaction mechanism of metal 尾 -lactamases CcrA with cefotaxime and ceftazidime cazo (ceftazidime) were studied. The main contents were as follows: 1. The expression of metal 尾 -lactamase CcrA was induced in E. coli. The target protein was separated and purified by nickel ion affinity chromatography. The protein was identified by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Finally, the content of the protein was determined by Bradford. The high expression of the target protein CcrA was achieved in this process, and the purity of the purified CcrA enzyme was high. The protein content was 0.26-0.28 mg / mL 路2.The molecular recognition and interaction between CcrA enzyme and two cephalosporins were studied by fluorescence spectrometry. The fluorescence spectra of the interaction between CcrA enzyme and CcrA enzyme were determined at three temperatures. The fluorescence quenching constants (Ksv) and quenching rate constants (K _ Q), binding constants (K _ Q), binding sites (n) and thermodynamic parameters in the binding process were obtained. The quenching between the two antibiotics and the CcrA enzyme was static quenching, and the Ksv and KQ of the system were higher than that of the combination system of CcrA and CAZ at the same temperature. The binding constant Ka and binding site number n of CcrA enzyme to CTX system are also relatively large, which indicates that the binding ability of CcrA enzyme to CTX is higher than that of CcrA enzyme and cazase, and it also shows that the binding capacity of CcrA enzyme to CTX is higher than that of CcrA enzyme. The results show that the Gibbs free energy and enthalpy change of the binding process are all negative, which indicates that the interaction between the CcrA enzyme and the CCAZ is spontaneous. The process of exothermic. 3. Molecular docking simulation was used to study the process of mutual recognition and interaction between CcrA enzyme and CTX caz. The interaction patterns of amino acid residues in enzyme molecules and functional groups in small molecular ligands were analyzed. It was found that the flexibility of the loop ring located near the active pockets of enzyme molecules changed greatly, which indicated that the interaction between the two molecules occurred in the process of interaction. The effect of induced binding makes the flexibility change of antibiotics into the loop loop of enzyme active pocket more favorable to the binding of enzyme molecules to antibiotics. The Gibbs free energy of the two binding systems is negative, which indicates that the binding process between CcrA enzyme and two antibiotics can be carried out spontaneously, which is consistent with the experimental results.
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R96

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