本文關(guān)鍵詞： 化學(xué)合成 人工核酸酶 非病毒基因載體 多胺　出處：《北京化工大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：分子生物學(xué)和分子藥理學(xué)的發(fā)展使人們能夠從基因水平理解某些生命現(xiàn)象,并通過合理的分子設(shè)計(jì)尋找有效的基因治療藥物或者有用的分子生物學(xué)工具。本論文以DNA為靶標(biāo)分子構(gòu)建了一系列多胺掛接型核酸調(diào)控試劑,并通過多種實(shí)驗(yàn)手段研究了其對核酸的識別、斷裂及介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)運(yùn)等方面作用,為進(jìn)一步深入理解、研究、開發(fā)出性能優(yōu)良的核酸斷裂試劑及基因轉(zhuǎn)運(yùn)工具奠定基礎(chǔ)。首先,選取兩類典型的對核酸具有一定識別與斷裂作用的多胺(Polyamine)配體分子即環(huán)狀多胺(tacn、cyclen、cyclam)和剛性平面多胺(IDB),掛接到具有鏈狀結(jié)構(gòu)的聚天門冬氨酸(PASP)骨架上形成多胺修飾的聚天門冬氨酸衍生物(PASP-polyamine)類新型核酸調(diào)控試劑。旨在利用PASP的骨架結(jié)構(gòu),提高和增強(qiáng)配體分子對核酸的作用效果,同時(shí)賦予結(jié)構(gòu)簡單、可生物降解的PASP作為功能性材料的能力。采用胺解開環(huán)方法對PASP-polyamine進(jìn)行合成,并通過NMR、ESI-MS、 MALDI-TOF等手段對關(guān)鍵中間體及終產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,同時(shí)采用核磁共振氫譜中特征峰的積分面積對PASP骨架上多胺的接枝率進(jìn)行了計(jì)算。在活性評價(jià)過程中,首先采用瓊脂糖凝膠電泳方法研究了PASP-polyamine (PASP-tacn、PASP-cyclen、PASP-cyclam、PASP-IDB)與DNA的作用情況,發(fā)現(xiàn)PASP-polyamine具有明顯的調(diào)控核酸雙鏈斷裂能力,而在相同的條件下單獨(dú)的配體分子和PASP均未顯示核酸斷裂能力。以PASP-cyclen為例,進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)PASP-cyclen(19.1 μM)在37℃、pH為7.4的緩沖溶液中作用3h即可對核酸的雙鏈產(chǎn)生切割作用,且隨著PASP-cyclen濃度的增加及反應(yīng)時(shí)間的延長,線形Form Ⅲ DNA為主要存在形態(tài),且這種切割能力是在無金屬離子存在下、水解方式進(jìn)行的特異性非隨機(jī)性雙鏈斷裂。此外,進(jìn)一步的構(gòu)效關(guān)系表明,PASP-polyamine的核酸斷裂能力的產(chǎn)生是受PASP骨架及骨架上裸露的羧基共同調(diào)控的。這一研究成果不僅豐富了人工核酸酶的研究內(nèi)容,并且為設(shè)計(jì)高效的非金屬類核酸斷裂試劑提供了新的設(shè)計(jì)方法及設(shè)計(jì)思路。進(jìn)一步,為了豐富多胺掛接型氨基酸聚合物類核酸調(diào)控試劑結(jié)構(gòu)的多樣性,在上述研究內(nèi)容的基礎(chǔ)上進(jìn)一步以天門冬氨酸(Asp)和賴氨酸(Lys)嵌段共聚物為骨架接枝多胺類分子,設(shè)計(jì)合成了PAL-cyclen。通過調(diào)節(jié)Asp與Lys不同的投料比例,制備出Asp/Lys=4:1、1:1及1：4三種不同氨基酸嵌段比的PAL-cyclen,并采用NMR、FT-IR、元素分析、GPC等手段對所制備的聚合物進(jìn)行全面的表征。初步的生物學(xué)評價(jià)表明,PAL-cyclen具有核酸凝聚作用,有望作為非病毒類基因載體。因此,為了考察PAL-cyclen在介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)運(yùn)方面的能力,接下來我們進(jìn)行了一系列相關(guān)的活性評價(jià)。采用瓊脂糖凝膠電泳、圓二色譜和熒光淬滅光譜手段定性、定量的討論了PAL-cyclen對DNA的親和能力及對核酸的保護(hù)情況。借助原子力顯微鏡、DLS技術(shù)及Zeta電位研究了PAL-cyclen/DNA復(fù)合物表面性質(zhì)及形態(tài)學(xué)。此外,對PAL-cyclen的體外細(xì)胞毒性及轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了評價(jià)。結(jié)果表明,PAL-cyclen與DNA能夠通過靜電作用結(jié)合,且所形成的復(fù)合物能夠保護(hù)DNA免受脫氧核糖核酸酶的降解。進(jìn)一步的形態(tài)學(xué)研究表明,PAL-cyclen與DNA可形成表面帶正電荷、直徑～100nm的納米粒子,該粒徑是作為基因載體的理想范圍,有利于通過胞吞作用被細(xì)胞攝取。同時(shí),PAL-cyclen對Hep G2細(xì)胞具有較低的細(xì)胞毒性,且能夠有效的介導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)運(yùn)到Hep G2細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)。因此,這一研究內(nèi)容在拓展多胺掛接型氨基酸類材料研究內(nèi)容的同時(shí),也為當(dāng)前非病毒基因載體材料存在的高毒性、低效率等問題提供了一種可能的解決方法及設(shè)計(jì)方向。
[Abstract]:The development of molecular biology and molecular pharmacology makes people understand some life phenomena from the gene level, and through the molecular design of reasonable gene finding effective drugs or useful molecular biological tools. This paper takes DNA as a target molecule to construct a series of polyamine hanging type nucleic acid regulating reagent, and studied its recognition of nucleic acid through many experiments, fracture and mediated gene transfer and other aspects of the role, for further understanding, research, development and lay the foundation of nucleic acid cleavage reagents and gene transfer tools with excellent performance. Firstly, selecting two typical recognition and fracture effect on nucleic acid polyamine (Polyamine) ligands that ring more amine (TACn, cyclen, cyclam) and rigid polyamine (IDB), poly aspartic acid is attached to the chain structure (PASP) modified poly aspartate to form skeleton Amino acid derivatives (PASP-polyamine) type of nucleic acid reagents. The regulation aims to use the framework of PASP, improve and enhance the effect of nucleic acid ligands, as has the advantages of simple structure, biodegradable PASP as functional materials. By using the method of synthesis of amine ring opening PASP-polyamine, and through NMR, ESI-MS, MALDI-TOF means were used to characterize the structures of the key intermediates and the final products, and the integral area of NMR characteristic peak of grafted on PASP skeleton polyamine rate was calculated. In the activity in the process of evaluation, the first PASP-polyamine was analyzed by agarose gel electrophoresis method (PASP-tacn, PASP-cyclen, PASP-cyclam, PASP-IDB) and the role of DNA, found that PASP-polyamine can regulate DNA double strand breaks significantly, and under the same conditions of ligand and PASP were not alone Display of nucleic acid cleavage ability. In the case of PASP-cyclen, PASP-cyclen found that further studies (19.1 M) at 37 C pH 7.4 buffer solution in 3h of double stranded nucleic acid can produce the cutting action, and with the increase of PASP-cyclen concentration and reaction time, linear Form III DNA was the main existing and this kind of form, cutting ability is the presence of metal ions in no way, hydrolysis of specific non random double strand breaks. In addition, further the structure-activity relationship showed that the nucleic acid cleavage ability of PASP-polyamine is produced by PASP skeleton and bone frame to control exposed carboxyl groups. These results not only enrich the research content of artificial nuclease, and provides a new design method and design ideas for non metal reagents to design efficient nucleic acid cleavage. Further, in order to enrich the polyamine hanging type amino acid polymer class The diversity of nucleic acid control reagents structure, based on the content above the aspartic acid (Asp) and lysine (Lys) copolymer as skeleton graft polyamine molecules, PAL-cyclen. and Lys Asp by adjusting the different proportion of the material were designed and synthesized, the preparation of Asp/Lys=4:1,1:1 and 1:4 in three different amino acid block ratio of PAL-cyclen, and the NMR, FT-IR, elemental analysis, GPC and other means to conduct a comprehensive characterization of the prepared polymer. The preliminary biological evaluation showed that, PAL-cyclen has a nucleic acid condensation, is expected as a non viral gene vector. Therefore, in order to study PAL-cyclen mediated gene transfer in the next, we carried out a series of related activity evaluation. By agarose gel electrophoresis, round two chromatography and fluorescence quenching spectroscopy qualitative, quantitative discussion the affinity of DNA PAL-cyclen The protection of nucleic acid. Using an atomic force microscope, DLS and Zeta potential of the surface properties of PAL-cyclen/DNA composite and morphology. In addition, in vitro cytotoxicity and transfection efficiency of PAL-cyclen was evaluated. The results showed that PAL-cyclen and DNA can be combined by static electricity, and the degradation complex formed to protect DNA from DNase. Morphological studies further showed that PAL-cyclen and DNA can be formed on the surface of positively charged nanoparticles, diameter 100nm, the particle size range is ideal for gene delivery, to endocytosis ingested by the cells. At the same time, PAL-cyclen has low cytotoxicity on Hep cells and G2. Can express effectively mediated transport of target gene to Hep G2 cells and proteins. Therefore, the research content in the development of polyamine hanging type amino acids material research At the same time, it also provides a possible solution and design direction for the high toxicity and low efficiency of current non viral gene carrier materials.

【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R91;R914.5

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本文編號：1512630