本文關(guān)鍵詞： 前列腺癌 靶向藥物 甲氨蝶呤 GnRH受體 偶聯(lián) PC-3細胞 荷瘤裸鼠 結(jié)構(gòu)鑒定 藥效學(xué) 米卡芬凈鈉 有關(guān)物質(zhì) 驗證　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的本課題以“配體-受體”特異性結(jié)合為理論基礎(chǔ),根據(jù)人前列腺癌PC-3細胞高表達GnRH受體而正常前列腺組織不表達GnRH受體的特點,設(shè)計合成了一種全新的具有腫瘤靶向性的靶向藥物,將甲氨蝶呤與GnRH配體通過共價偶聯(lián)方式結(jié)合在一起,形成GnRH-MTX偶聯(lián)物,然后通過體外細胞實驗和體內(nèi)藥效學(xué)實驗探討了GnRH-MTX偶聯(lián)物的抗腫瘤活性及其在體內(nèi)分布特性,為尋找一種高效、低毒抗前列腺癌靶向藥物奠定基礎(chǔ)。方法1.首先以MTX和GnRH多肽為原料,通過兩步反應(yīng)制備合成出GnRH-MTX偶聯(lián)物。然后通過一系列先進分析手段如核磁共振,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀等手段對化合物GnRH-MTX的結(jié)構(gòu)進行鑒定。2.以GnRH-MTX偶聯(lián)物和游離MTX為受試物,通過CCK8法和流式細胞儀等手段,研究比較MTX偶聯(lián)前后對人前列腺癌PC-3細胞株和人正常前列腺成纖維細胞HPrF細胞株的體外細胞毒性。3.利用PC-3細胞接種BALB/c裸鼠建立了前列腺癌荷瘤裸鼠動物模型,以此為實驗動物模型,評價GnRH-MTX偶聯(lián)物靜脈給藥對荷瘤(PC-3)裸鼠的抑瘤效果。4.建立MTX體內(nèi)HPLC含量測定方法,然后再以荷瘤裸鼠為動物模型,以MTX和GnRH-MTX為受試藥物,經(jīng)過靜脈給藥后,測定荷瘤裸鼠各臟器的MTX含量,以兩組動物的各臟器組織中MTX的含量高低為指標,評價GnRH-MTX是否具有前列腺癌靶向性。結(jié)果1.通過兩步合成法成功的合成了GnRH-MTX偶聯(lián)物,第一步活性酯反應(yīng)條件如下：反應(yīng)摩爾比為MTX:EDC.HCL:NHS:DMAP=2:6:6:1,在25℃、無水無氧和避光的條件下反應(yīng)24小時,簡單處理反應(yīng)液,經(jīng)硅膠柱色譜(v乙酸乙酯：V石油醚=1：6)分離提純,反應(yīng)產(chǎn)率為72.36%；第二步GnRH-MTX偶聯(lián)物的反應(yīng)條件是反應(yīng)摩爾比為MTX活性酯：GnRH多肽=1.5：1,在25℃下反應(yīng)4小時,反應(yīng)終止時緩慢加入乙醚進行沉淀,終止反應(yīng),簡單處理反應(yīng)液后,將粗品通過反相制備液相色譜,純化得到GnRH-MTX偶聯(lián)靶向藥物；化合物的色譜純度為98.35%,終產(chǎn)物約1500 mg,反應(yīng)產(chǎn)率為88.98%；同時經(jīng)過MS測定化合物的分子量為1632,與理論值相符合；同時還用HNMR化合物進行了進一步的驗證,確定合成所得到的產(chǎn)物與預(yù)期產(chǎn)物相吻合。2.CCK8實驗結(jié)果顯示,MTX偶聯(lián)前后對PC-3細胞和對正常前列腺成纖維細胞HPrF細胞的細胞毒性,藥物作用于細胞24小時,MTX對PC-3細胞的IC50為1.36μmol/L;GnRH-MTX偶聯(lián)物對PC-3細胞的IC50為0.41μmol/L;而MTX對正常HPrF細胞的IC50為147.19 μmol/L, GnRH-MTX偶聯(lián)物對正常HPrF細胞的IC50為93.63 μmol/L;同時利用流式細胞儀對檢測了MTX及其偶聯(lián)物作用于PC-3細胞后的細胞凋亡率,實驗結(jié)果為：MTX組作用于細胞24小時,空白對照組PC-3細胞凋亡率為5.71%;濃度為0.24 μmol/L時,凋亡率為10.56%；濃度為0.98 μmol/L時,凋亡率為62.21%;濃度為3.91 μmol/L時,凋亡率為70.33%;GnRH-MTX組作用于細胞24小時,空白對照組PC-3細胞凋亡率為4.12%；濃度為0.24 μmol/L時,凋亡率為20.31%；濃度為0.98 μmol/L時,凋亡率為77.31%；濃度為3.91 μmol/L時,凋亡率為98.71%。隨著給藥濃度的增加,細胞凋亡率也增加。3.體內(nèi)藥效學(xué)實驗表明：給藥結(jié)束時,各組相對腫瘤增殖率(T/C)如下：比卡魯胺組25.67%,甲氨蝶呤組36.85%,GnRH多肽組95.77%,低劑量組40.67%,中劑量組33.47%,高劑量組30.84%；給藥結(jié)束時還通過剝離腫瘤塊稱重計算了腫瘤抑制率,各組腫瘤抑制率為：比卡魯胺組的抑瘤率為：79.47%;甲氨蝶呤組的抑瘤率為：69.54%；多肽組的抑瘤率為：9.27%;而低、中和高劑量組抑瘤率分別為67.55%、76.82%和79.47%。相對腫瘤增殖率和和腫瘤抑制率等數(shù)據(jù)均表明MTX經(jīng)過與GnRH偶聯(lián)之后,抗前列腺癌效果提高了。4.建立了HPLC方法檢測MTX在荷瘤裸鼠各臟器中的濃度,MTX能夠與樣品中的其他干擾物有效分離,該方法快速、靈敏度高和專屬性好；靶向性實驗研究結(jié)果：GnRH-MTX偶聯(lián)物和游離MTX等摩爾注射給藥后,游離MTX給藥后在腫瘤組織中的藥物濃度為4.27 mg/kg,而GnRH-MTX偶聯(lián)物在腫瘤組織中的MTX濃度則為13.61 mg/kg,表明MTX經(jīng)過偶聯(lián)之后藥物更具有腫瘤靶向性了。結(jié)論1. 以MTX和GnRH多肽為原料,通過兩步合成法成功的合成了GnRH-MTX偶聯(lián)物,反應(yīng)操作簡單,耗時少,反應(yīng)條件溫和,反應(yīng)產(chǎn)率高。2.體外細胞學(xué)實驗表明,GnRH-MTX偶聯(lián)物對高表達GnRH受體的前列腺癌PC-3細胞抗腫瘤活性明顯強于游離的MTX。3. GnRH-MTX偶聯(lián)物能夠有效抑制人前列腺癌PC-3裸鼠移植瘤的“瘋狂”生長,GnRH-MTX偶聯(lián)物的對荷瘤(PC-3)裸鼠的抑瘤效果較游離MTX的抑瘤效果有明顯提高。4.MTX通過與GnRH多肽偶聯(lián)之后,GnRH-MTX偶聯(lián)物在荷瘤(PC-3)裸鼠體內(nèi)具有腫瘤靶向性,藥物在荷瘤裸鼠體內(nèi)的組織分布也發(fā)生了變化。綜上所述,GnRH配體可作為靶向藥物的載體,將藥物靶向遞送至GnRH受體高表達的腫瘤細胞,起到減毒增效作用,實現(xiàn)腫瘤靶向治療。此外,本論文還對米卡芬凈鈉進行了研究,建立了米卡芬凈鈉有關(guān)物質(zhì)分析方法,液相色譜條件為：采用等度洗脫,色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18 column (250×4.6 mm,5μm),流動相為磷酸鹽緩沖液(1.2g磷酸二氫鈉和6.15 g高氯酸鈉溶于1000 mL超純水中,用磷酸調(diào)節(jié)PH至2.9)：乙腈=62：38(V/V),流速為1.0 mL/min,柱溫為45℃,檢測波長為210 nm,進樣量為10 μ L。并對該分析方法進行了方法學(xué)驗證,驗證項目包括系統(tǒng)適應(yīng)性、專屬性、定量限、檢測限、線性、準確度、精密度、溶液穩(wěn)定性和耐用性等。經(jīng)驗證,該方法專屬性好、靈敏度高、線性范圍好,回收率高,重現(xiàn)性好,耐用性好,該方法適用于米卡芬凈鈉原料藥的有關(guān)物質(zhì)測定：然后同時應(yīng)用此方法對米卡芬凈進行了強降解研究,在堿性條件下和氧化條件下較不穩(wěn)定,在酸性條件下和光照條件下中等穩(wěn)定,在水解條件和熱降解條件下較為穩(wěn)定。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R914;R96
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本文編號：1503443