本文關(guān)鍵詞： 羅格列酮 過氧化物酶體增殖物激活受體γ 抑郁癥 自噬 凋亡　出處：《南京醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：抑郁癥(depression)是心境障礙的一種,其主要臨床特征是心境低落、思維遲緩、認知功能損害、意志活動減退和軀體癥狀。據(jù)WHO最新的統(tǒng)計結(jié)果顯示,全球抑郁癥患病率高達12.8%,并預測2020年抑郁癥將成為全球第二位醫(yī)療疾患。目前臨床常用的抗抑郁藥治療作用有限,并且副作用明顯。因此,尋求安全可靠且治療效果顯著的抗抑郁藥迫在眉睫。抑郁癥患者中常出現(xiàn)前額葉-邊緣系統(tǒng)的葡萄糖低代謝特征,提示能量代謝損傷可能都是抑郁癥臨床癥狀產(chǎn)生的神經(jīng)生物學基礎(chǔ)。除此之外,抑郁癥和代謝性疾病還存在很多共同的病理特征,如血糖代謝失衡、慢性炎癥反應、神經(jīng)-內(nèi)分泌紊亂等。因此,抑郁癥與代謝性疾病有著十分密切的關(guān)系。羅格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物(Thiazolidinedione,TZD),臨床上作為胰島素增敏劑用于治療2型糖尿病。越來越多的研究證實羅格列酮對包括腦卒中、阿爾茨海默病在內(nèi)的多種神經(jīng)精神類疾病具有神經(jīng)保護作用。但是,羅格列酮在抑郁癥中的作用及機制尚不清楚。本文從在體(慢性溫和不可預知應激所致抑郁癥模型小鼠)和離體(皮質(zhì)酮誘導損傷的細胞模型)水平評價羅格列酮對抑郁癥的潛在治療作用及機制。研究結(jié)果將為抑郁癥治療提供新的思路和實驗依據(jù)。目的:研究、闡明羅格列酮對抑郁癥模型小鼠的實驗性治療作用及機制。方法:1.應用糖水偏愛測試(sucrose preference test,SPT)、強迫游泳(forced swimming test,FST)和開場(open field test,OFT)等行為學實驗,評價小鼠CMS模型及羅格列酮對抑郁樣行為的影響。2.免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence,IF)檢測前額葉皮層和海馬石蠟切片中NeuN標記的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)標記的星形膠質(zhì)細胞和CD1 1b標記的小膠質(zhì)細胞數(shù)量、形態(tài)及相關(guān)蛋白的表達情況。3.酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測動物血清中 IL-6、TNFα、IGF1、VEGF、CNTF 的濃度4.培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及N2a細胞系,應用免疫細胞化學(immunocytochemistry,ICC)染色結(jié)合體視學技術(shù),檢測細胞陽性率。5.用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)或者乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)法檢測細胞活力。6.透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察細胞自噬小體的形成及數(shù)量。7.采用Annexin-Ⅴ和PI對星形膠質(zhì)細胞進行雙染,并用流式細胞分選儀檢測原代星形膠質(zhì)細胞的凋亡率。8.應用免疫印跡法(western blotting,WB)檢測動物組織及細胞樣本中自噬相關(guān)蛋白LC3、AMPK、P62、ULK1及凋亡相關(guān)蛋白caspase3、Bax、Bcl-2、PARP的表達情況。9.實時定量聚合酶鏈反應技術(shù)(real-time quantification polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測細胞轉(zhuǎn)染si-PPARy的效率及細胞因子和STRAD、M025的表達情況。結(jié)果:1.羅格列酮改善CMS引起的小鼠抑郁樣行為羅格列酮(5 mg/ml)能升高CMS模型小鼠的糖水偏愛率,并使其平均體重增加3.7 g;與CMS組小鼠相比,羅格列酮能顯著增加小鼠在FST中的運動時間,延長小鼠在OFT中的中心停留時間。2.羅格列酮能緩解CMS引起的前額葉皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞損傷,并增強海馬區(qū)的神經(jīng)再生能力應用TUNEL染色顯示,羅格列酮能減少皮層細胞的凋亡;通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn),羅格列酮能夠增加CMS小鼠前額葉皮層中星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量,并改善神經(jīng)元軸突的密度。同時,羅格列酮增加海馬CA1區(qū)中Ki67標記的新生神經(jīng)元數(shù)目,表明羅格列酮具有改善抑郁癥小鼠神經(jīng)再生的作用。3.羅格列酮能抑制小鼠體內(nèi)的炎癥反應,改善細胞因子分泌的紊亂通過qPCR和ELISA實驗發(fā)現(xiàn),CMS造模導致小鼠血清和前額葉皮層中IL-1β、IL-6、TNFα的濃度及mRNA水平升高,而羅格列酮能逆轉(zhuǎn)這些炎癥因子的升高趨勢;羅格列酮還能增加血清中CNTF和IGF1的濃度;使血清中皮質(zhì)酮的濃度下降至366 ng/ml(CMS組為713 ng/ml)。4.羅格列酮上調(diào)前額葉皮層神經(jīng)元自噬水平并抑制凋亡羅格列酮使自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、ULK1、Beclin1及p-AMPK/AMPK表達升高,而降低P62的表達。隨后的免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn),與CMS組相比,羅格列酮使NeuN標記陽性神經(jīng)元中LC3B的表達升高約68%。另外,羅格列酮促進 Bcl-2/Bax、p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt 和 p-IRS1/IRS1 等蛋白表達。5.羅格列酮通過激活LKB1/AMPK通路,促進原代皮層神經(jīng)元和N2a細胞的自噬皮質(zhì)酮(10 μM)刺激導致原代皮層神經(jīng)元和N2a細胞活力降低,而羅格利酮給藥可以對抗皮質(zhì)酮所致細胞的損傷。應用透射電鏡觀察結(jié)果顯示,羅格列酮能增加自噬小體的形成;進一步對自噬相關(guān)蛋白ATG5、LC3、ULK1、P62等表達的分析表明,羅格列酮能逆轉(zhuǎn)CMS引起的自噬水平降低。羅格列酮所引起的上述改變均可被PPARy拮抗劑T0070907阻斷;敲低和過表達PPARγ表達后,羅格列酮能明顯降低或升高LKB1、STRAD、M025的表達,從而影響羅格列酮對N2a細胞的神經(jīng)保護作用。這些結(jié)果提示,羅格列酮作用于PPARγ、激活LKB1/AMPK通路,從而促進神經(jīng)元自噬,產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。6.羅格列酮通過增加IGF1R的表達、激活Akt/CREB通路,抑制皮質(zhì)酮所致星形膠質(zhì)細胞的損傷應用流式細胞術(shù)檢測AV/PI雙染細胞、WB分析Bcl-2/Bax、caspase 3、PARPp85等蛋白的表達,結(jié)果顯示:羅格列酮具有抗凋亡作用。IGF1R在星形膠質(zhì)細胞中表達明顯高于神經(jīng)元;羅格列酮增加IGF1R及其底物IRS1的磷酸化表達(分別增加約175%和86%),促進下游Akt、CREB的磷酸化,進而起到保護星形膠質(zhì)細胞的做用。7.羅格列酮改善皮質(zhì)酮誘導的星形膠質(zhì)細胞功能紊亂,進而保護皮層神經(jīng)元應用皮質(zhì)酮和羅格列酮處理的星形膠質(zhì)細胞所產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元,結(jié)果顯示條件培養(yǎng)基能對抗皮質(zhì)酮所致神經(jīng)元損傷、使細胞活力增加49%,同時細胞核皺縮的神經(jīng)元數(shù)目顯著減少。應用MAP2熒光探針標記條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的神經(jīng)元,發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基具有促進神經(jīng)元軸突生長的作用。結(jié)論:羅格列酮通過促進神經(jīng)元自噬、抑制星形膠質(zhì)細胞凋亡,從而發(fā)揮抗抑郁效應。本文工作的主要創(chuàng)新之處:1.發(fā)現(xiàn)羅格列酮能減輕CMS和皮質(zhì)酮所致神經(jīng)元/星形膠質(zhì)細胞損傷的作用,為將其發(fā)展為抑郁癥藥物提供了實驗依據(jù);2.闡明羅格列酮通過激活LKB1/AMPK通路促進神經(jīng)元自噬、激活Akt/CREB通路抑制星形膠質(zhì)細胞凋亡,從而產(chǎn)生神經(jīng)保護的作用機制。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R965

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本文編號：1468032