本文關(guān)鍵詞： 新霉素抗性篩選 新產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物 結(jié)構(gòu)鑒定 抗腫瘤活性　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：微生物代謝產(chǎn)物是新藥及其先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的重要來(lái)源,其中真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物因具有豐富的化學(xué)多樣性倍受人們關(guān)注。然而在對(duì)野生真菌進(jìn)行活性篩選時(shí),絕大多數(shù)菌株因不具備相關(guān)的生物學(xué)活性而被棄置,造成了大量自然資源的浪費(fèi)。微生物基因組學(xué)的研究表明,在常規(guī)的培養(yǎng)條件下,大多數(shù)次級(jí)代謝相關(guān)基因(簇)處于沉默狀態(tài),不能進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)生相應(yīng)的次級(jí)代謝產(chǎn)物。近年來(lái),本課題組圍繞如何激活真菌中沉默的次級(jí)代謝途徑,建立了一系列簡(jiǎn)便而有效的實(shí)驗(yàn)技術(shù)新方法,包括DMSO介導(dǎo)的硫酸二乙酯誘變,超聲介導(dǎo)的抗生素抗性導(dǎo)入,以及DMSO介導(dǎo)的抗生素抗性導(dǎo)入等。最近,本課題組又通過(guò)以無(wú)抗腫瘤活性的海洋來(lái)源產(chǎn)紫青霉G59作為原始菌株,采用DMSO介導(dǎo)的新霉素抗性篩選方法,獲得了數(shù)十株具有抗腫瘤活性的新霉素抗性突變株。本文通過(guò)對(duì)DMSO介導(dǎo)新霉素抗性篩選所得到的3株突變株進(jìn)行抗性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),對(duì)突變株的新霉素抗性導(dǎo)入情況進(jìn)行確認(rèn)。在此過(guò)程中,將新霉素抗性突變株4-30、PDN-10-2、PDN-v-2及其相應(yīng)對(duì)照原始菌G59的新鮮孢子液,用新霉素分別按篩選獲取各突變株時(shí)處理G59孢子所采用相同實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行處理,然后涂布于PDA培養(yǎng)基上,28°C培養(yǎng)并逐日觀察。對(duì)比原始菌G59與突變株在生長(zhǎng)狀態(tài)上的差別,發(fā)現(xiàn)原始菌G59的生長(zhǎng)受到了明顯的抑制,而突變株的生長(zhǎng)則無(wú)明顯抑制,表明突變株已獲得了新霉素抗性,抗性篩選實(shí)驗(yàn)取得了成功。從課題組前期獲得的突變株中挑選8株活性突變株,進(jìn)行了抗腫瘤活性復(fù)篩,以考察突變株的活性穩(wěn)定性。對(duì)8株新霉素突變株的發(fā)酵提取物進(jìn)行HPLC分析,觀察對(duì)比突變株與原始菌代謝產(chǎn)物的差異。最終,從這8株突變株中選擇了活性穩(wěn)定,代謝產(chǎn)物豐富并與原始菌G59差異明顯的突變株4-30作為繼續(xù)研究的對(duì)象。對(duì)突變株4-30分別進(jìn)行了液體培養(yǎng)基以及固體培養(yǎng)基的大量發(fā)酵,并從中選擇性地分離在原始菌G59中不產(chǎn)而在突變株中新產(chǎn),且具有抗腫瘤活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。在對(duì)突變株4-30液體培養(yǎng)基大量發(fā)酵的研究中,首先進(jìn)行了發(fā)酵時(shí)效考察的預(yù)實(shí)驗(yàn),初步明確了發(fā)酵培養(yǎng)的最佳時(shí)間。在具體的產(chǎn)物分離過(guò)程中采用了化學(xué)分析檢測(cè)引導(dǎo)活性追蹤分離的手段,綜合利用各種分離分析技術(shù),從中獲得了5個(gè)具有抗腫瘤活性的新產(chǎn)化合物(化合物1-5)。為了進(jìn)一步考察突變株4-30的代謝能力,更加深入地挖掘突變株的新產(chǎn)活性次級(jí)代謝產(chǎn)物,我們對(duì)突變株4-30進(jìn)行了固體培養(yǎng)基的大量發(fā)酵。產(chǎn)物分離采用與之前相同的策略,獲得了4個(gè)具有抗腫瘤活性的新產(chǎn)化合物(化合物6-9)。綜合應(yīng)用現(xiàn)代波譜技術(shù)(UV、IR、CD、NMR等)以及改良Mosher方法對(duì)上述化合物1-9的結(jié)構(gòu)進(jìn)行闡明�；衔�6為新結(jié)構(gòu)化合物,屬于自然界罕見(jiàn)的Cyclopentachromones(CPCs)類(lèi)化合物,在其結(jié)構(gòu)中存在一含硫側(cè)鏈,并通過(guò)硫醚鍵的形式來(lái)與母核中脂肪環(huán)部分相連接,這樣的結(jié)構(gòu)在CPCs類(lèi)化合物中尚屬首次發(fā)現(xiàn)。根據(jù)HMBC譜中提供的信號(hào),可知化合物6在五元環(huán)上取代基的位置也具有一定獨(dú)特性,與之前所報(bào)道過(guò)的該類(lèi)化合物取代的位置均不相同。通過(guò)對(duì)母核中遠(yuǎn)程C-H偶合常數(shù)的分析,結(jié)合Karplus方程的計(jì)算,確定了骨架中C-2與C-3的相對(duì)結(jié)構(gòu),進(jìn)一步通過(guò)計(jì)算簡(jiǎn)化結(jié)構(gòu)ECD,并與實(shí)驗(yàn)測(cè)量CD進(jìn)行比對(duì)分析,確定了五元環(huán)上的絕對(duì)構(gòu)型。經(jīng)改良Mosher法實(shí)驗(yàn),確定了化合物6側(cè)鏈C-17位連羥手性碳的絕對(duì)構(gòu)型。通過(guò)對(duì)化合物6同類(lèi)化合物生合成規(guī)律的分析,分別找出了骨架結(jié)構(gòu)與側(cè)鏈前體的來(lái)源,并對(duì)其可能的生合成途徑進(jìn)行合理的推測(cè)。聯(lián)合使用HPLC-PDAD-UV與HPLC-ESI-MS的分析方法,以上述分離得到的單體化合物1-9作為參照,對(duì)原始菌G59以及突變株4-30液、固體培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯提取物在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,化合物1-9均在突變株4-30的發(fā)酵樣品中檢測(cè)到,而在原始菌G59的發(fā)酵樣品中則沒(méi)有檢測(cè)到,表明化合物1-9均為突變株4-30中新產(chǎn)的次級(jí)代謝產(chǎn)物。這說(shuō)明突變株4-30在引入抗性的過(guò)程中激活了原本在G59中沉默的次級(jí)代謝相關(guān)途徑,根據(jù)所得到的化合物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來(lái)看,這其中可能包括聚酮合成酶途徑(PKS)以及非核糖體肽合成酶途徑(NPRS)以及其它復(fù)雜的生合成途徑。正是這些原本沉默的相關(guān)次級(jí)代謝合成途徑的被激活,導(dǎo)致突變株4-30獲得了可代謝產(chǎn)生原本在G59中所不能產(chǎn)生,且具有一定抗腫瘤活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力。以人癌細(xì)胞K562、HL-60、BGC-823、Hela以及MCF-7作為受試對(duì)象,分別對(duì)單體化合物1-9進(jìn)行初步抗腫瘤活性測(cè)試。100μg/mL濃度下化合物1-9對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞作用24小時(shí)后,均顯示出一定的抑制活性,抑制率介于27%~89%,相同濃度陽(yáng)性參照5-氟尿嘧啶對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率介于42%~47%。化合物1-3,5-7,9還分別進(jìn)行了IC50值的測(cè)試。其中新化合物6顯示出了良好的抗腫瘤活性,對(duì)上述五種人癌細(xì)胞的IC50值介于16~75μM之間�？傊�,通過(guò)DMSO介導(dǎo)的新霉素抗性篩選,可以將原本無(wú)抗腫瘤活性的產(chǎn)紫青霉G59轉(zhuǎn)化成具有抗腫瘤活性的突變株。隨著突變株4-30新霉素抗性的引入,次級(jí)代謝相關(guān)途徑較原始菌G59發(fā)生了改變,因而可以從其代謝產(chǎn)物中分離得到結(jié)構(gòu)新穎且具有抗腫瘤活性的化合物。這是一種對(duì)真菌次級(jí)代謝資源開(kāi)發(fā)利用的新方法,在實(shí)驗(yàn)室條件下簡(jiǎn)便易行,對(duì)于拓展菌株藥用資源,深入挖掘真菌次級(jí)代謝潛力相關(guān)工作具有重要的參考意義。
[Abstract]:In recent years , the mutant strain 4 - 30 , PDN - 10 - 2 , PDN - v - 2 and its corresponding control primitive bacteria G59 were treated with the same experimental conditions . In this paper , the relative structure of C - 2 and C - 3 in the nucleus was determined by the analysis of the chemical synthesis law of compound 6 . The results showed that the compound 1 - 9 could be used as reference for the secondary metabolites of C - 2 and C - 3 in G59 .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R915

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本文編號(hào)：1449514