本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌高表達攜帶功能性小RNA的重組RNA方法的建立　出處：《浙江大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：小RNA是指一類小片段的非編碼RNA,主要通過RNA-RNA相互作用而對目標RNA進行調(diào)控,其中最重要和被廣泛研究的作用即RNAi。RNAi是指由RNA分子介導(dǎo)的基因抑制,其包含了兩大類RNA分子:microRNA和siRNA。microRNA是一類內(nèi)源性的～22 nt的非編碼小RNA,在生物體中廣泛存在并具有高度的保守性,主要通過與mRNA的3'UTR結(jié)合,抑制基因翻譯或者誘導(dǎo)mRNA的降解。siRNA是一類外源性或人工合成的～22 nt的非編碼小RNA,其作用機制與microRNA相似,但可與目標mRNA的任意部位結(jié)合并介導(dǎo)mRNA的降解。RNAi在基因功能研究和疾病治療方面都有廣泛的應(yīng)用,目前已有多種基于RNAi的藥物進入臨床試驗。RNA適配體(RNA aptamer)是指能與給定的特定分子相結(jié)合的小片段的RNA,主要通過體外 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)篩選而成。由于RNA適配體對其目標分子具有高度的特異性和親和性,因而在生物化學(xué)的研究和疾病的治療中有著廣闊的應(yīng)用前景,且已有RNA適配體(Pegaptanib)被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準。目前用于RNAi和適配體研究的RNA試劑,主要采用化學(xué)或體外轉(zhuǎn)錄合成,成本較高。本課題通過生物技術(shù)的方法,成功構(gòu)建OnRS(optimal noncoding RNA scaffold)骨架,并用于在大腸桿菌中高表達了具有生物學(xué)功能的microRNA,siRNA和RNA適配體,為RNA的研究提供了一種經(jīng)濟快捷高效的合成手段。1.OnRS骨架的構(gòu)建通過tRNA支架在大腸桿菌中大量表達RNA已有報道,本章旨在構(gòu)建含有不同的microRNA前體片段的質(zhì)粒,通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌來表達不同的microRNA前體。首先利用人的基因組DNA為模板,根據(jù)不同的microRNA前體的序列設(shè)計不同的引物以擴增前體片段,采用無縫克隆(seamless cloning)的方法分別構(gòu)建表達各個microRNA前體的質(zhì)粒。將構(gòu)建好的質(zhì)粒測序驗證后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行RNA的表達,提取細菌中的總RNA,通過變性聚丙烯酰胺/尿素凝膠電泳鑒定目標的microRNA前體在細菌總RNA中的表達量,結(jié)果顯示,除了 tRNA/mir-34a,tRNA/mir-125b-1和tRNA/mir-1291之外,其余重組RNA在細菌總RNA中的表達量相當?shù)?有的甚至沒有表達。由于在所測定的11個microRNA前體的表達中,mir-34a的表達量最高,為了用這個系統(tǒng)大量表達其他的microRNA,我們采用不同microRNA的成熟序列替換microRNA 34a前體中miR-34a,再根據(jù)microRNA 34a前體中的堿基配對方式同時改變其3'序列,并將這個新的結(jié)構(gòu)命名為OnRS。2.OnRS 高表達 microRNA(OnRS/miR-124)及功能研究本章利用OnRS的原理,將miR-124的序列替換microRNA34a前體中miR-34a的序列擬構(gòu)建能在大腸桿菌中表達含有miR-124序列的重組RNA的質(zhì)粒OnRS/miR-124,并同時插入一段隨機序列構(gòu)建一個實驗所需的對照質(zhì)粒OnRS/Neg。將構(gòu)建好的質(zhì)粒測序鑒定后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,提取總RNA,電泳鑒定,結(jié)果顯示目的RNA能在大腸桿菌中大量表達。用FPLC(fast protein liquid chromatography)純化目的重組RNA后,將OnRS/miR-124轉(zhuǎn)染A549細胞,兩天后收集細胞,提取總RNA,進行小RNA的深度測序。測序結(jié)果表明,OnRS/miR-124能在細胞中被加工產(chǎn)生成熟的miR-124,細胞中其余小RNA的表達未發(fā)生明顯變化,同時OnRS/miR-124中的tRNA也能在細胞中被加工成tRFs(tRNA fragments),且不同重組RNA之間tRFs的量無明顯差異。確定OnRS/miR-124能在細胞中產(chǎn)生出大量成熟的miR-124序列后,進一步對其功能進行鑒定。結(jié)果表明,miR-124的靶蛋白STAT3和p-STAT3能被OnRS/miR-124所抑制,且OnRS/miR-124能夠抑制細胞的增殖,同時誘導(dǎo)細胞凋亡,與文獻報道相符合。上述結(jié)果表明,利用OnRS能夠成功在大腸桿菌中表達具有生物學(xué)功能的microRNA。3.OnRS 高表達 siRNA(OnRS/GFP-siRNA)及功能研究確定OnRS能夠成功表達microRNA后,鑒于microRNA和siRNA有著相似的作用機制,本課題進一步探索其是否能用于siRNA的表達。本章利用OnRS的原理,設(shè)計并構(gòu)建了能表達一段22nt的GFP-siRNA的質(zhì)粒OnRS/GFP-siRNA,質(zhì)粒通過測序鑒定正確后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,提取總RNA,經(jīng)電泳鑒定,結(jié)果表明重組RNA在大腸桿菌中大量表達。通過FPLC純化后,將OnRS/GFP-siRNA轉(zhuǎn)染ES-2 GFP細胞,兩天后提取總RNA進行小RNA的深度測度。測序結(jié)果表明OnRS/GFP-siRNA能在細胞中被加工產(chǎn)生成熟的GFP-siRNA,細胞中其余小RNA的表達未發(fā)生明顯變化,OnRS/GFP-siRNA中的tRNA也能在細胞中被加工成tRFs,且不同重組RNA之間tRFs的量無明顯差異。同時,OnRS/GFP-siRNA轉(zhuǎn)染ES-2 GFP細胞,48 h及72 h之后都能發(fā)現(xiàn)和對照組相比細胞的熒光強度明顯降低,轉(zhuǎn)染72 h后測定GFP的mRNA表達同對照組相比明顯降低。在確定OnRS/GFP-siRNA體外能有效抑制GFP的表達之后,進一步進行了體內(nèi)實驗的驗證。對于高表達GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠靜脈注射OnRS/GFP-siRNA和對照的OnRS/Heg,取小鼠肝臟,冷凍切片,觀察OnRS/GFP-siRNA比對照組熒光強度明顯降低,同時測定肝臟中GFPmRNA的表達與對照組相比也有顯著降低。上述結(jié)果表明,利用OnRS能夠成功在大腸桿菌中表達具有生物學(xué)功能的siRNA。4.OnRS高表達適配體(OnRS/MGA)及其在RNase活性測定中的應(yīng)用研究本章進一步探索是否能利用OnRS表達功能性的RNA適配體。根據(jù)文獻設(shè)計了能在OnRS的5'端或3'端表達孔雀石綠(malachitegreen,MG)適配體(MGA)的質(zhì)粒OnRS/MGA5和OnRS/MGA3。轉(zhuǎn)化細菌后提取總RNA鑒定,OnRS/MGA5和OnRS/MGA3都能在大腸桿菌中大量表達且能與MG結(jié)合皆能使MG的最大吸收從618 nm轉(zhuǎn)移到630 nm,同時也能增強MG在630/655nm處的熒光。在確定OnRS能成功表達出功能性的MGA后,進一步考察了 OnRS/MGA5在測定核糖核酸酶活性方面的應(yīng)用。首先確定熒光強度能隨著MG和OnRS/MGA5濃度的增加而不斷升高。同時,OnRS/MGA5能被人體中主要的核糖核酸酶RNaseA和血管生成素(Angiogenin)所降解。在確定OnRS/MGA5能被核糖核酸酶降解后,由于血清中富含多種核糖核酸酶,故進一步測定血清對OnRS/MGA5的降解。結(jié)果發(fā)現(xiàn),OnRS/MGA5能被血清中的核糖核酸酶所降解,且熒光值與血清的量之間呈現(xiàn)經(jīng)典的劑量-效應(yīng)關(guān)系,同時加入核糖核酸酶抑制劑可使OnRS/MGA5與MG結(jié)合的熒光值保持不變。另外,基因傳遞試劑in vivo-jetPEI也能有效抑制血清中核糖核酸酶對OnRS/MGA5的降解。因此,擬采用OnRS/MGA5作為一個無標記的底物來測定不同病人血清樣品中Rnase的活性。測定發(fā)現(xiàn),胰腺癌病人血清中核糖核酸酶的活力(196±22)明顯高于良性或正常人(118 ±8)。這為胰腺癌臨床診斷也提供了一定依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;R91

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