本文關鍵詞：人凝血因子Ⅷ生產環(huán)節(jié)中的近紅外定量分析研究

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【摘要】：人凝血因子Ⅷ (coagulation factor Ⅷ, FⅧ)是治療甲型血友病和獲得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血癥狀等的不可或缺的藥品,但我國當前整個血液制品行業(yè)長期處于供不應足的狀態(tài),因此提高產品的活性收率以及比活性是解決現(xiàn)狀的一個必要舉措。國內FⅧ的生產過程多采用離子交換層析法,從人血漿冷沉淀中分離純化FⅧ,包括酸沉淀、A50吸附、S/D滅活、層析、超濾、凍干等主要環(huán)節(jié),由于缺乏很好的過程控制方法,導致產品收率低、比活低。因此,有必要針對生產現(xiàn)狀,將現(xiàn)代過程分析與控制技術引入到FⅧ生產過程中的關鍵環(huán)節(jié)當中,增加對生產工藝過程的了解,有效控制工藝過程,提升FⅧ的收率及比活性。近紅外光譜分析技術(Near Infrared Spectroscopy, NIRS)是當前最重要的一種過程分析技術(Process Analytical Technology, PAT),具有快速準確無損等優(yōu)勢,在制藥行業(yè)中已有較為廣泛的應用,在血液制品中的應用也有研究。本課題選取FⅧ生產過程中的酸沉淀、層析洗脫和凍干環(huán)節(jié)為研究對象,采用NIRS結合不同的化學計量學方法,嘗試建立了針對FⅧ比活性、效價以及水分的定量分析模型,為其在線應用奠定了基礎。具體研究內容如下：1.FⅧ酸沉淀過程分析和近紅外定量模型的建立本實驗考察了人凝血因子Ⅷ生產過程中酸沉淀終點控制方法的合理性,然后用近紅外光譜分析技術建立了FⅧ比活性的偏最小二乘(partial least squares,PLS)定量分析模型,選取了測定過一級數(shù)據(jù)的108個樣品光譜參與建模,其中隨機選取6次試驗的64個樣品劃入校正集,另外4次試驗的44個樣品劃入驗證集,通過對校正集樣品和驗證集樣品的含量分布以及主成分得分圖進行分析,證明分類結果比較理想,滿足樣品集的劃分要求。通過對校正集樣品的統(tǒng)計分析,將杠桿值或學生化殘差值過高的樣品進行判斷,若確為異常樣品則予以剔除。在光譜測量過程中不可避免地會引入噪聲和產生基線漂移,在建立校正模型前有必要對光譜進行適當?shù)念A處理,微分可以有效消除基線的漂移,放大信號差異,平滑多與微分聯(lián)用,可有效提高信噪比,標準化(Autoscale)可以賦予光譜中所有波長的變量相同的權重,凸顯樣品光譜的差異,最終選擇這3種預處理方法—一階微分+SG13點平滑十標準化,采用處理后的光譜數(shù)據(jù)建立PLS校正模型,模型的各項參數(shù)較為理想,Rc=0.9649, Rp=0.9229, RMSEC=0.0576, RMSEP=0.0493。對建立好的模型進行預測精密度的考察,在驗證集樣品中隨機選取3個樣品,包含不同的FⅧ比活性值,重復測量6次光譜,然后采用建立的模型通過采集光譜得到樣品的預測值,經(jīng)計算預測值的相對標準偏差在5%左右,且隨著比活的升高而減小,證明此分析方法具有較好的重復性,可用于未知樣品的預測。2.人凝血因子Ⅷ層析過程中洗脫液效價的近紅外定量分析研究本實驗建立了FⅧ層析過程中洗脫液FⅧ效價的定量模型。層析洗脫過程獲得了68個樣品,FⅧ效價分布比較均勻,符合樣品集的要求,且不存在顯著異常點。比較不同方法的PLS建模結果可知,選擇中心化(Meancenter)+基因算法(Genetic algorithm, GA)所建立的PLS模型R2為0.9010、RMSEP為0.4090,既有較高的線性,也降低了預測誤差,它是所使用的最佳PLS建模方法。而采用ANN、SVM方法建立模型,其結果表明采用sigmoid傳輸函數(shù)的BP-ANN建模方法的R2=0.942, RMSEC=0.3754, RMSEP=0.4272,是所有方法中最佳的建模方式。這可能是因為FⅧ的效價是物質的活性信息,較為復雜,與物質的濃度不成定量線性關系,所以采用非線性的回歸方法能夠得到更好的建模結果。應用近紅外光譜分析技術和此定量模型,可以在FⅧ層析洗脫過程中針對FⅧ效價進行特異性監(jiān)測,從而更準確的控制收集洗脫液的起點和終點。3.人凝血因子Ⅷ冷凍干燥過程中水分含量的近紅外定量分析研究本實驗利用近紅外光譜和相關的化學計量學建立了FⅧ凍干過程中水分含量的定量檢測模型,通過考察不同的預處理方法和光譜區(qū)間選擇方法,最終確定了正交信號校正(OSC)結合二階導數(shù)加SG平滑的預處理方法,以及GA作為譜區(qū)選擇方法。所建立模型的主要參數(shù)為R2=0.918, RMSEC=0.2141, RMSECV=0.4102, RMSEP=0.3848,均處于可以接受的范圍內。通過驗證,模型的線性、分辨能力、準確度和精密度等均符合要求,證明了該模型的實用性與有效性。該模型的建立,是實現(xiàn)在線監(jiān)測凍干過程中FⅧ制劑水分含量變化的堅實基礎,一旦在線監(jiān)測系統(tǒng)得以實現(xiàn),凍干時間將得到極大的優(yōu)化,避免因凍干時間過長造成的FⅧ活性損失,而利用光纖進行多點監(jiān)控,可以保證整批產品的水分含量都達到標準,使不合格產品的數(shù)量達到最低。本論文的創(chuàng)新點有：本研究首次將近紅外光譜分析技術應用于人凝血因子Ⅷ的生產過程研究,分別建立了酸沉淀過程中FⅧ比活性的PLS定量模型、層析過程中洗脫液FⅧ效價的定量分析模型和凍干過程中水分含量變化的定量分析模型。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R927;O657.33

【參考文獻】

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1 褚小立;袁洪福;陸婉珍;;近年來我國近紅外光譜分析技術的研究與應用進展[J];分析儀器;2006年02期

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本文編號：1188391