本文關(guān)鍵詞：β2受體激動(dòng)劑沙美特羅對(duì)NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的全身性炎癥的調(diào)節(jié)及機(jī)制

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【摘要】：炎癥(Inflammation)是十分常見而又相當(dāng)重要的病理過程,它可以發(fā)生于機(jī)體內(nèi)各部位的組織和器官。傳統(tǒng)意義的炎癥指具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子的防御性反應(yīng),體表的外傷感染和各器官的大部分常見病都屬于炎癥性疾病,例如毛囊炎、扁桃體炎、肺炎、腎炎、肝炎等等。炎癥的本質(zhì)是防御,以變質(zhì)、滲出和增生為基本病理變化,臨床主要表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛等。近年來,原本被認(rèn)為與炎癥無關(guān)的多種疾病,如多發(fā)性硬化、阿爾茲海默癥、帕金森病、II型糖尿病等,均有研究報(bào)道其發(fā)病機(jī)制與炎癥有關(guān),因此,對(duì)機(jī)體的炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控已經(jīng)成為當(dāng)今刻不容緩的研究重點(diǎn)。NLRP3炎癥小體是NLRs炎癥小體家族的一員,也是目前研究最廣泛的NLR家族成員,主要表達(dá)于外周單核巨噬細(xì)胞。近年來,人們逐漸發(fā)現(xiàn)炎癥小體在各類炎癥性疾病中發(fā)揮了重要作用,炎癥小體也逐漸成為各類炎癥發(fā)病機(jī)制中的研究熱點(diǎn)。巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要呈遞細(xì)胞,其在特異性和非特異性免疫中均發(fā)揮重要作用,是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。巨噬細(xì)胞是一種組織內(nèi)的白細(xì)胞,是由骨髓中的干細(xì)胞分化而來。巨噬細(xì)胞容易獲得,便于培養(yǎng),并可進(jìn)行純化。近年來,巨噬細(xì)胞在全身性炎癥反應(yīng)與NLRP3炎癥小體中的作用逐漸受到重視。腎上腺素受體是介導(dǎo)兒茶酚胺作用的一類組織受體,為G-蛋白耦聯(lián)受體(Gprotein coupled receptors, GPCR)。根據(jù)其對(duì)去甲腎上腺素的不同反應(yīng)情況,分為腎上腺素能a受體和p受體。其中,β2腎上腺素受體是一種GPCR受體,能夠調(diào)控許多生理功能,例如呼吸道平滑肌、血管平滑肌的活動(dòng)等。p2受體已被證明在包括巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、T細(xì)胞及B細(xì)胞等免疫細(xì)胞上表達(dá),并且刺激β2受體能夠影響這些細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。研究表明短效和長(zhǎng)效β2受體激動(dòng)劑均能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。然而,β2受體激動(dòng)劑在外周中對(duì)全身性炎癥的作用目前未見研究。沙美特羅是一種β2受體激動(dòng)劑,通過其對(duì)呼吸道平滑肌的作用,已被廣泛應(yīng)用于哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)的抗炎治療,但目前仍缺乏沙美特羅對(duì)全身性炎癥反應(yīng)的研究。因此,本研究提取C57BL/6J小鼠的原代骨髓源性巨噬細(xì)胞,制備細(xì)胞炎癥模型,研究β2受體激動(dòng)劑沙美特羅是否能夠通過NLRP3炎癥小體在發(fā)揮抗炎作用及其作用機(jī)制。結(jié)合LPS制備C57BL/6J小鼠全身性炎癥模研究、闡明沙美特羅在全身性炎癥中所發(fā)揮的抗炎作用及其機(jī)制,揭示沙美特羅的新穎藥理作用,并為未來全身性炎癥的治療提供新思路。目的：研究β2受體激動(dòng)劑對(duì)NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥的調(diào)節(jié)及機(jī)制。方法：1.應(yīng)用原代骨髓源性巨噬細(xì)胞,給予LPS+ATP刺激建立細(xì)胞炎癥模型,同時(shí)給予10-12M～10-7M等不同濃度的沙美特羅,闡明沙美特羅發(fā)揮抗炎作用的有效濃度。2.應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)上述細(xì)胞中NLRP3炎癥小體各組分的蛋白表達(dá)水平(NLRP3、 caspase-1、IL-1β),研究沙美特羅對(duì)NLRP3炎癥小體活性的影響。3.應(yīng)用原代骨髓源性巨噬細(xì)胞上,給予LPS+ATP、poly(dA:dT)、MDP、Flagellin等刺激,激活多種不同的炎癥小體,給予上述有效濃度的沙美特羅,闡明沙美特羅對(duì)NLRP3炎癥小體作用的特異性。4.應(yīng)用cAMP檢測(cè)試劑盒對(duì)原代骨髓源性巨噬細(xì)胞中的cAMP表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),評(píng)價(jià)沙美特羅的抗炎作用是否依賴cAMP信號(hào)通路。5.應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)β-arrestin1、β-arrestin2的蛋白表達(dá)水平。在骨髓源性巨噬細(xì)胞中干擾β-arrestin1、2的表達(dá)后評(píng)價(jià)沙美特羅的抗炎作用是否被取消。應(yīng)用免疫共沉淀(Co-IP)方法,觀察沙美特羅對(duì)NLRP3炎癥小體與β-arrestin2結(jié)合的影響。結(jié)果：1.在原代BMDM細(xì)胞上,10-10M-10-7M濃度的沙美特羅有抗炎作用,并且其抗炎作用被KH7取消,被H89部分取消。2.沙美特羅主要通過NLRP3炎癥小體發(fā)揮抗炎作。3.在原代BMDM上干擾β-arrestinl的表達(dá)后抑制NLRP3炎癥小體的激活。10-10M濃度的沙美特羅能升高cAMP的表達(dá),呈劑量依賴性。4.沙美特羅能夠逆轉(zhuǎn)LPS+ATP所引起的β-arrestin2下調(diào),干擾β-arrestin2后,沙美特羅的抗炎作用被抑制。10-10M濃度的沙美特羅能促進(jìn)β-arrestin2與NLRP3的相互作用。結(jié)論：1.沙美特羅能夠通過調(diào)控NLRP3炎癥小體發(fā)揮抗炎作用。2.臨床濃度的沙美特羅主要通過經(jīng)典GPCR-cAMP通路發(fā)揮抗炎作用,而極低濃度的沙美特羅則通過非經(jīng)典β-arrestin2通路發(fā)揮抗炎作用。綜上所述,本文的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于：1.揭示β2受體激動(dòng)劑沙美特羅在全身性炎癥中的抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)沙美特羅能夠顯著抑制LPS+ATP所誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng),并在LPS所致的炎癥模型小鼠上驗(yàn)證了極低濃度沙美特羅的抗炎作用,為將沙美特羅等β2腎上腺素受體激動(dòng)劑發(fā)展為抗炎藥物積累學(xué)術(shù)基礎(chǔ)。2.發(fā)現(xiàn)不同濃度的沙美特羅通過不同的信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)10-7M濃度的沙美特羅主要通過經(jīng)典的GPCR-G蛋白-第二信使通路發(fā)揮抗炎作用,而10-0M濃度的沙美特羅主要通過非經(jīng)典的GPCR-β-arrestin2信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。該結(jié)果為深入研究p2腎上腺素受體乃至GPCR的偏向激活的原理提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96

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1 ;188沙美特羅在慢性阻塞型肺疾病治療作用中的評(píng)價(jià)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(內(nèi)科學(xué)分冊(cè));1998年07期

2 朱淑玉;新藥沙美特羅[J];哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1999年03期

3 蔣翠鶯;孫文R，

本文編號(hào)：1175847