本文關(guān)鍵詞：重組融合蛋白rMBP-NAP的毒理學(xué)研究

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【摘要】：幽門螺旋桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(Hp-NAP)與大腸桿菌的麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)通過基因工程等技術(shù)融合得到的新型重組蛋白rMBP-NAP,研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在通過免疫療法治療癌癥和其他與免疫異常相關(guān)的疾病時(shí),有一定的效果,因此,重組融合蛋白rMBP-NAP可以作為一種新型的免疫調(diào)節(jié)候選藥物。本課題通過一系列試驗(yàn),包括rMBP-NAP的急性毒性試驗(yàn)、rMBP-NAP的90天長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)、rMBP-NAP的小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn),對(duì)rMBP-NAP的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究主要包括以下幾個(gè)方面:(1)融合蛋白rMBP-NAP的制備將實(shí)驗(yàn)室前期已有的工程菌E.coli TB1(pMAL-c2x-napA)在37℃搖床培養(yǎng),加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)3h產(chǎn)生融合蛋白rMBP-NAP,低溫離心大量收集菌體后進(jìn)行超聲破碎,取超聲低溫離心后的上清進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳,驗(yàn)證融合蛋白rMBP-NAP的可溶性,然后采用親和層析方法純化融合蛋白rMBP-NAP,將純化后的蛋白用PBS透析,并采用BCA蛋白定量法和Iamge J2X對(duì)純化后的融合蛋白rMBP-NAP分別定量和測(cè)定純度。(2)rMBP-NAP的急性毒性試驗(yàn)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用最大耐受量法(MTD)對(duì)小鼠尾靜脈注射rMBP-NAP。小鼠按照性別隨機(jī)分為兩組,其中給藥組20只,PBS陰性對(duì)照組10只,給藥組最大給藥劑量125mg/kg是治療劑量的25倍。給藥后連續(xù)觀察7天并做記錄。結(jié)果表明直至給藥期結(jié)束沒有出現(xiàn)小鼠死亡,給藥期間沒有異常的活動(dòng)情況。處死小鼠后對(duì)小鼠進(jìn)行解剖并觀察,沒有出現(xiàn)明顯的病變器官。(3)rMBP-NAP的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將給大鼠靜脈注射不同劑量的融合蛋白rMBP-NAP。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組,rMBP-NAP給藥組21mg/kg、42mg/kg和PBS陰性對(duì)照組。連續(xù)尾靜脈給藥90天觀察大鼠毒性反應(yīng)。90天給藥期結(jié)束后處死部分大鼠,取血樣和主要器官檢測(cè),其余大鼠在30天恢復(fù)期后處死做同樣處理。結(jié)果顯示給藥期大鼠體重與對(duì)照組相比有明顯差異,血常規(guī)無影響,給藥組的血液生化指標(biāo)和組織病理學(xué)結(jié)果顯示,肝、腎可能為毒性靶器官。受試動(dòng)物在經(jīng)過30天恢復(fù)期后各項(xiàng)指標(biāo)基本恢復(fù)正常。(4)rMBP-NAP的小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)隨機(jī)將50只昆明鼠分為5組,雌雄各半,分別為陰性PBS對(duì)照組,陽性環(huán)磷酰胺對(duì)照組,rMBP-NAP給藥組為5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg,連續(xù)5天尾靜脈給藥,末次給藥24h后處死小鼠,制骨髓細(xì)胞片染色計(jì)數(shù)。結(jié)果表明rMBP-NAP給藥組微核率與陰性對(duì)照組相比無明顯差異。(5)rMBP-NAP的鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)四個(gè)劑量受試藥物分別為50μg/每皿、200μg/每皿、1000μg/每皿和4000μg/每皿,均包括加S9和不加S9兩種情況。用測(cè)試菌株TA97,TA98,TA100,TA102檢測(cè),結(jié)果表明,rMBP-NAP在200~4000μg/每皿劑量范圍內(nèi)對(duì)TA98,TA100,TA102有致基因突變作用;在1000~4000μg/每皿劑量范圍內(nèi)對(duì)TA97有致基因突變作用。本研究通過急性毒性試驗(yàn)、長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn),確定了rMBP-NAP的毒性靶器官是肝臟和腎臟,rMBP-NAP過量給藥后具有致突變作用,對(duì)哺乳動(dòng)物的微核數(shù)目沒有影響。這為rMBP-NAP后期的臨床研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R965

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本文編號(hào)：1140920