本文關(guān)鍵詞：單核細(xì)胞激活試驗(yàn)方法在單克隆抗體藥物熱原檢測(cè)中的應(yīng)用研究

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【摘要】：本課題針對(duì)目前傳統(tǒng)熱原檢測(cè)方法的不足,研究單核細(xì)胞激活試驗(yàn)方法(Monocyte-Activation Test,MAT)在單克隆抗體藥物熱原檢測(cè)中的應(yīng)用,希望能夠更好地評(píng)價(jià)單克隆抗體藥物的安全性。本課題的工作如下:一、建立一種新的單核細(xì)胞激活試驗(yàn)。參照歐洲藥典(European Pharmacopoeia,EP)、英國(guó)藥典(British Pharmacopeia,BP)及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)5種單核細(xì)胞及相關(guān)的細(xì)胞因子進(jìn)行篩選,找到對(duì)熱原敏感的細(xì)胞系及相應(yīng)的細(xì)胞因子,并對(duì)該試驗(yàn)的重要參數(shù)如接種細(xì)胞密度、孵育時(shí)間、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)濃度等進(jìn)行探討研究。(1)本試驗(yàn)探討了人白血病THP-1、SJ1細(xì)胞、淋巴瘤Raji、WIL2-S細(xì)胞和人紅白血病K562細(xì)胞在內(nèi)毒素(endotoxin,也稱磷酸脂多糖lipopolysaccharide,LPS)、酵母多糖(zysoman)和脂壁酸(lipoteichoic acid,LTA)常見(jiàn)熱原的刺激下分泌白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的量,結(jié)果表明SJ1細(xì)胞在LPS、zysoman、LTA的刺激下分泌的IL-6的量與陰性對(duì)照有明顯區(qū)別,而其他細(xì)胞對(duì)熱原刺激均不敏感,因此,SJ1/IL-6法可能是一種新的單核細(xì)胞激活試驗(yàn)方法;(2)探討了細(xì)胞密度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響,結(jié)果表明當(dāng)細(xì)胞接種密度在1.0×105個(gè)/m L~1.0×107個(gè)/m L范圍內(nèi),LPS、zysoman、LTA刺激SJ1細(xì)胞后,細(xì)胞分泌IL-6的量隨細(xì)胞密度的增大而增加,最終確定該試驗(yàn)接種的細(xì)胞密度為5.0×106個(gè)/m L;(3)探討不同孵育時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響,試驗(yàn)結(jié)果表明熱原刺激SJ1細(xì)胞48小時(shí),細(xì)胞分泌IL-6的量最高,最終確定熱原孵育時(shí)間為48小時(shí);(4)探討FBS濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響,結(jié)果表明當(dāng)FBS濃度在0.5%~20%的范圍內(nèi),隨著FBS濃度的降低,LPS、zysoman、LTA刺激SJ1細(xì)胞后,細(xì)胞分泌IL-6的量逐漸增加,最終確定用含2%FBS濃度的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。通過(guò)以上探討,首次建立了SJ1/IL-6單核細(xì)胞激活試驗(yàn)作為熱原檢測(cè)的補(bǔ)充試驗(yàn)。二、對(duì)SJ1細(xì)胞進(jìn)行鑒定。按歐洲藥典、中國(guó)藥典(Chinese Pharmacopoeia,Ch P)中相關(guān)章節(jié)對(duì)細(xì)胞系的要求,對(duì)SJ1細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)鑒定、無(wú)菌檢查、支原體檢查、外源病毒污染檢查、細(xì)胞功能穩(wěn)定性檢查。鏡下觀察到本實(shí)驗(yàn)室SJ1細(xì)胞的形態(tài)與美國(guó)菌種保藏中心(American type culture collection,ATCC)細(xì)胞庫(kù)中細(xì)胞形態(tài)一致。無(wú)菌檢查、支原體檢查和外源病毒污染檢查均按照2015版中國(guó)藥典相關(guān)規(guī)定進(jìn)行檢查,結(jié)果均為陰性。細(xì)胞功能穩(wěn)定性檢查包括測(cè)定不同代次細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和不同代次細(xì)胞熱原敏感性。結(jié)果表明各個(gè)代次細(xì)胞生長(zhǎng)曲線基本一致;細(xì)胞生長(zhǎng)到10代左右對(duì)熱原刺激最敏感,細(xì)胞生長(zhǎng)到20代以后,對(duì)熱原刺激的敏感性逐漸下降。三、對(duì)建立的SJ1/IL-6方法進(jìn)行準(zhǔn)確度、重復(fù)性、定量限、線性和專屬性的驗(yàn)證。測(cè)得LPS?zysoman?LTA在流感疫苗、凍干人用狂犬病疫苗、麻腮風(fēng)聯(lián)合減毒活疫苗、麻疹腮腺炎聯(lián)合減毒活疫苗的回收率均在50%~200%范圍內(nèi),表明該方法在以上品種熱原測(cè)定中準(zhǔn)確度良好。對(duì)A群C群腦膜炎球菌疫苗進(jìn)行內(nèi)毒素含量測(cè)定,RSD值小于20%(n=6),表明該方法的重復(fù)性良好。LPS、zysoman、LTA的檢測(cè)限分別為0.06EU/m L,0.06μg/m L和0.06μg/m L。用一系列濃度的LPS?zysoman?LTA標(biāo)準(zhǔn)品溶液刺激SJ1細(xì)胞后,IL-6的分泌量與不同濃度LPS?zysoman?LTA的線性關(guān)系良好,R2均大于0.95。四、將SJ1/IL-6法與傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(the Bacterial Endotoxins test,BET)進(jìn)行比較。分別用本實(shí)驗(yàn)室建立的SJ1/IL-6方法和中國(guó)藥典收載的濁度法,測(cè)定兩個(gè)廠家10個(gè)批次A群C群腦膜炎疫苗球菌多糖疫苗的內(nèi)毒素含量,經(jīng)t-檢驗(yàn)分析兩種方法測(cè)得的10個(gè)批次的A群C群腦膜炎疫苗球菌多糖疫苗內(nèi)毒素含量無(wú)顯著性差別(P0.05)。五、考察該方法在阿達(dá)木單抗注射液熱原檢測(cè)中的應(yīng)用。對(duì)該方法用于阿達(dá)木單抗注射液熱原檢測(cè)進(jìn)行了系統(tǒng)的探討。(1)測(cè)3種熱原在阿達(dá)木單抗注射液2倍、10倍、20倍、50和100倍稀釋液中的回收率,結(jié)果表明阿達(dá)木單抗注射液稀釋倍數(shù)大于50倍時(shí),LPS、zysoman、LTA的回收率均在50%~200%范圍內(nèi),因此阿達(dá)木單抗注射液在稀釋50倍時(shí)適合用該方法進(jìn)行熱原檢測(cè);(2)探討高、中、低3種濃度LPS、zysoman、LTA在阿達(dá)木單抗50倍稀釋液中的回收率變化情況,結(jié)果表明3種濃度LPS、zysoman、LTA在阿達(dá)木單抗50倍稀釋液中的回收率均在50%~200%范圍內(nèi),說(shuō)明該方法用于阿達(dá)木單抗注射液熱原檢測(cè)時(shí)準(zhǔn)確度較好;(3)將稀釋50倍的不含內(nèi)毒素的阿達(dá)木注射液加入LPS(LPS終濃度為0.25EU/m L)刺激SJ1細(xì)胞,測(cè)分泌的IL-6的量,RSD值小于20%(n=6),說(shuō)明該方法用于阿達(dá)木單抗注射液熱原檢測(cè)時(shí)重復(fù)性較好;(4)用該方法測(cè)定5個(gè)不同批號(hào)阿達(dá)木熱原含量,結(jié)果均為陰性。六、考察該方法在其他單抗樣品熱原檢測(cè)中的應(yīng)用。將該方法應(yīng)用于注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白、尼妥珠單抗注射液、重組抗CD25人源化單克隆抗體注射,雷珠單抗注射液和貝伐珠單抗注射液的熱原檢測(cè),測(cè)LPS、zysoman、LTA在這5種單抗合適稀釋倍數(shù)下的的回收率以及這5種單抗熱原含量。結(jié)果表明,LPS、zysoman、LTA在這5種單抗注射液的回收率均在50%~200%范圍內(nèi),測(cè)得的內(nèi)毒素含量結(jié)果均為陰性。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R927.1
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-17
• 第1章:緒論17-25
• 1.1 熱原檢查17-19
• 1.1.1 家兔法17
• 1.1.2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法17-18
• 1.1.3 單核細(xì)胞激活試驗(yàn)18-19
• 1.2 單克隆抗體藥物19-21
• 1.2.1 單克隆抗體藥物生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)介20
• 1.2.2 單克隆抗體藥物安全性控制項(xiàng)目20-21
• 1.2.3 單抗藥物的熱原檢查21
• 1.3 本課題立題依據(jù)21-22
• 1.3.1 國(guó)內(nèi)熱原檢測(cè)現(xiàn)狀21-22
• 1.3.2 國(guó)外熱原檢測(cè)現(xiàn)狀22
• 1.4 本課題主要研究?jī)?nèi)容22-25
• 第2章：?jiǎn)魏思?xì)胞激活試驗(yàn)方法的建立25-37
• 2.1 試劑和儀器25-26
• 2.1.1 試劑和耗材25
• 2.1.2 儀器25-26
• 2.2 試驗(yàn)方法26-28
• 2.2.1 熱原標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制26
• 2.2.2 試驗(yàn)用細(xì)胞培養(yǎng)26
• 2.2.3 操作方法26-28
• 2.3 試驗(yàn)結(jié)果28-35
• 2.3.1 細(xì)胞系篩選試驗(yàn)結(jié)果28-31
• 2.3.2 細(xì)胞密度的探討結(jié)果31-32
• 2.3.3 藥物作用時(shí)間的探討結(jié)果32-33
• 2.3.4 FBS濃度的探討結(jié)果33-35
• 2.4 本章小結(jié)35-37
• 第3章：SJ1細(xì)胞的鑒定37-45
• 3.1 試劑與儀器37-38
• 3.1.1 試劑和耗材37
• 3.1.2 儀器37-38
• 3.2 試驗(yàn)方法38-40
• 3.2.1 細(xì)胞鑒別38
• 3.2.2 無(wú)菌檢查38-39
• 3.2.3 支原體檢查39
• 3.2.4 外源病毒污染檢查39
• 3.2.5 不同代次細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定性檢查39-40
• 3.2.6 不同代次細(xì)胞熱原敏感性檢查40
• 3.3 試驗(yàn)結(jié)果40-43
• 3.3.1 細(xì)胞鑒別檢查結(jié)果40-41
• 3.3.2 無(wú)菌檢查試驗(yàn)結(jié)果41
• 3.3.3 支原體檢查試驗(yàn)結(jié)果41
• 3.3.4 外源病毒污染檢查試驗(yàn)結(jié)果41-42
• 3.3.5 不同代次細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定性檢查結(jié)果42
• 3.3.6 不同代次細(xì)胞的熱原敏感性檢查結(jié)果42-43
• 3.4 本章小結(jié)43-45
• 第4章：方法驗(yàn)證45-57
• 4.1 試劑與儀器45-46
• 4.1.1 試劑和耗材45-46
• 4.1.2 儀器46
• 4.2 試驗(yàn)方法46-49
• 4.2.1 熱原標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制46-47
• 4.2.2 樣品溶液的配制47-48
• 4.2.3 試驗(yàn)用細(xì)胞培養(yǎng)48-49
• 4.2.4 細(xì)胞鋪板49
• 4.2.5 加樣及孵育49
• 4.2.6 細(xì)胞因子IL-6 的測(cè)定49
• 4.3 試驗(yàn)結(jié)果49-54
• 4.3.1 準(zhǔn)確度49-50
• 4.3.2 重復(fù)性50
• 4.3.3 線性50-52
• 4.3.4 定量限52-54
• 4.4 本章小結(jié)54-57
• 第5章：SJ1/IL-6 法與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的比較57-61
• 5.1 試劑與儀器57-58
• 5.1.1 試劑和耗材57
• 5.1.2 儀器57-58
• 5.2 試驗(yàn)方法58-59
• 5.2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制58
• 5.2.2 樣品溶液的配制58
• 5.2.3 試驗(yàn)用細(xì)胞培養(yǎng)58
• 5.2.4 細(xì)胞鋪板58-59
• 5.2.5 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品溶液的加樣及孵育59
• 5.2.6 細(xì)胞因子IL-6 的測(cè)定59
• 5.3 試驗(yàn)結(jié)果59-60
• 5.4 本章小結(jié)60-61
• 第6章：SJ1/IL-6 法在阿達(dá)木單抗樣品熱原檢測(cè)中的應(yīng)用研究61-69
• 6.1 試劑與儀器61-62
• 6.1.1 試劑和耗材61
• 6.1.2 儀器61-62
• 6.2 試驗(yàn)方法62-64
• 6.2.1 熱原標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制62
• 6.2.2 樣品溶液的配制62-63
• 6.2.3 試驗(yàn)用細(xì)胞培養(yǎng)63
• 6.2.4 細(xì)胞鋪板63
• 6.2.5 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品溶液的加樣及孵育63-64
• 6.2.6 細(xì)胞因子IL-6 的測(cè)定64
• 6.3 試驗(yàn)結(jié)果64-67
• 6.3.1 LPS、zysoman、LTA在不同稀釋倍數(shù)的阿達(dá)木單抗注射液中的回收率64-65
• 6.3.2 不同濃度LPS、zysoman、LTA在稀釋50倍的阿達(dá)木中的回收率65-66
• 6.3.3 阿達(dá)木樣品內(nèi)毒素含量重復(fù)6次測(cè)定結(jié)果66
• 6.3.4 阿達(dá)木樣品LPS、zysoman、LTA含量的測(cè)定結(jié)果66-67
• 6.4 本章小結(jié)67-69
• 第7章 SJ1/IL-6 法在其他各類單抗樣品熱原檢測(cè)中的應(yīng)用研究69-75
• 7.1 試劑與儀器69-70
• 7.1.1 試劑與耗材69
• 7.1.2 儀器69-70
• 7.2 試驗(yàn)方法70-71
• 7.2.1 樣品溶液的配制70-71
• 7.2.2 其他71
• 7.3 試驗(yàn)結(jié)果71-73
• 7.3.1 各單抗樣品LPS、zysoman、LTA回收率測(cè)定結(jié)果71-72
• 7.3.2 各單抗樣品LPS、zysoman、LTA含量測(cè)定結(jié)果72-73
• 7.4 本章小結(jié)73-75
• 參考文獻(xiàn)75-79
• 全文總結(jié)79-81
• 創(chuàng)新性分析81-83
• 對(duì)進(jìn)一步研究工作的設(shè)想和建議83-84
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文、專利申請(qǐng)84-85
• 致謝85

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本文編號(hào)：1085632