本文關(guān)鍵詞：一種發(fā)形霞水母來(lái)源多肽生長(zhǎng)因子的生物學(xué)活性研究

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【摘要】：本課題組致力于發(fā)形霞水母(Cyanea capillata,C.capillata)來(lái)源的活性物質(zhì)及相關(guān)機(jī)理研究多年。以往研究中,我們發(fā)現(xiàn)水母觸手表現(xiàn)出超強(qiáng)創(chuàng)傷修復(fù)能力,且觸手中刺細(xì)胞具有快速增殖的特點(diǎn),提示水母觸手中可能存在高活性促生長(zhǎng)因子。在分析C.capillata觸手提取物(tentacle extract,TE)的細(xì)胞活性時(shí)也觀察到一個(gè)有趣現(xiàn)象,即低濃度的T E可以誘發(fā)細(xì)胞增殖。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,我們推測(cè)TE中含有類似促增殖活性物質(zhì)。本課題組前期建立了C.capillata觸手組織c DNA文庫(kù),分析發(fā)現(xiàn)其中有四條血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)類似序列,為我們從TE中提取促生長(zhǎng)活性物質(zhì)提供了重要理論依據(jù)。組合應(yīng)用多種分離技術(shù),我們成功從TE中分離得到具有促生長(zhǎng)活性的一個(gè)顆粒蛋白樣多肽生長(zhǎng)因子并命名為Cc GRN-1(Cyanea capillata granulin-1,Cc GRN-1)。因此,本課題將重點(diǎn)研究TE和Cc GRN-1的促生長(zhǎng)活性及其作用機(jī)制。通過本課題的研究,我們希望可以為將來(lái)某些特殊疾病或環(huán)境造成的傷口難愈合情況提供新的治療思路。方法第一部分:TE的生物學(xué)活性研究首先,采用CCK-8法檢測(cè)TE對(duì)HUVECs細(xì)胞活力的影響。然后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TE對(duì)HUVECs細(xì)胞周期進(jìn)程的影響;并檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin B1和Cyclin D1表達(dá)的影響。隨后,采用Western Blotting檢測(cè)TE對(duì)HUEVCs中生長(zhǎng)相關(guān)信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)情況,包括PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK,JNK MAPK,p38 MAPK和NF-κB通路以及下游caspase-3,8,9和Cyto C蛋白的表達(dá)水平;同時(shí),采用免疫熒光技術(shù)對(duì)信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)情況進(jìn)一步驗(yàn)證。隨后,選擇TE激活的信號(hào)通路對(duì)應(yīng)的抑制劑,檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響。最后,采用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TE對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。第二部分:Cc GRN-1的生物學(xué)活性研究首先,采用CCK-8法檢測(cè)Cc GRN-1對(duì)HUVECs的細(xì)胞活力的影響。其次,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Cc GRN-1對(duì)HUVECs細(xì)胞周期進(jìn)程的影響,并檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin B1和Cyclin D1的表達(dá)變化情況。然后,采用Western Blotting檢測(cè)Cc GRN-1對(duì)HUEVCs中生長(zhǎng)相關(guān)信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)情況,主要包括PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK,JNK MAPK和NF-κB通路;同時(shí),采用免疫熒光技術(shù)對(duì)信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)情況做進(jìn)一步的驗(yàn)證。隨后,選擇Cc GRN-1激活的信號(hào)通路對(duì)應(yīng)的抑制劑,檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響。最后,采用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cc GRN-1的促細(xì)胞遷移能力。同時(shí),選取商品化血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF作為對(duì)照,并行分析其與Cc GRN-1的生物學(xué)活性及作用機(jī)制。結(jié)果第一部分:TE的生物學(xué)活性研究CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示,高劑量TE抑制細(xì)胞生長(zhǎng),使HUVECs細(xì)胞活力呈劑量依賴性降低;而低劑量TE可以促進(jìn)細(xì)胞活力明顯升高。此外,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,TE可以促進(jìn)細(xì)胞從G1期過渡到細(xì)胞分裂活躍期(S和G2期),加快細(xì)胞周期進(jìn)程;TE還可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)明顯增加。在信號(hào)通路方面,TE可以激活HUVECs中PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK以及JNK MAPK通路,而對(duì)p38 MAPK和NF-κB通路以及下游信號(hào)通路中包括caspase-3,8,9以及Cyto C蛋白表達(dá)沒有影響;免疫熒光檢測(cè)結(jié)果證實(shí)TE確實(shí)可以激活PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK以及JNK MAPK通路。信號(hào)通路干預(yù)結(jié)果顯示PD98059可以抑制Cyclin B1和Cyclin D1的表達(dá),而LY294002和SP600125對(duì)其沒有影響,說(shuō)明TE主要是通過激活ERK1/2 MAPK通路上調(diào)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的。最后,細(xì)胞劃痕修復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明,TE可以誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生細(xì)胞遷移。第二部分:Cc GRN-1的生物學(xué)活性研究CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示,Cc GRN-1和VEGF均對(duì)HUVECs活力具有時(shí)間和劑量依賴性促進(jìn)作用。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,兩者均可以促進(jìn)細(xì)胞從G1期過渡到細(xì)胞分裂活躍期(S和G2期),加快細(xì)胞周期進(jìn)程;此外,兩者還可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)增加。在信號(hào)通路激活方面,Western Blotting結(jié)果顯示Cc GRN-1和VEGF均可以激活PI3K/Akt和ERK1/2 MAPK通路,而對(duì)JNK MAPK和NF-κB通路沒有影響;免疫熒光檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了Cc GRN-1和VEGF確實(shí)可以激活PI3K/Akt和ERK1/2 MAPK通路。信號(hào)通路干預(yù)結(jié)果顯示PD98059可以抑制Cyclin B1和Cyclin D1的表達(dá),而LY294002沒有影響,說(shuō)明Cc GRN-1主要是通過激活ERK1/2 MAPK通路上調(diào)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的。最后,細(xì)胞劃痕修復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明,Cc GRN-1和VEGF均可以誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生細(xì)胞遷移。結(jié)論低濃度TE可以提高細(xì)胞活力,加快細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá),提示TE具有促細(xì)胞增殖效應(yīng);在作用機(jī)制方面,TE可以磷酸化激活PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK和JNK MAPK通路,而其中的ERK1/2 MAPK通路與細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)增加密切相關(guān),提示其可能與促細(xì)胞增殖有關(guān);最后,細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)表明TE可以誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。另一方面,Cc GRN-1具有與VEGF類似的細(xì)胞活力效應(yīng),可以加快細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá),表明Cc GRN-1具有與VEGF類似的促細(xì)胞增殖效應(yīng);在作用機(jī)制方面,Cc GRN-1也與VEGF類似,主要激活PI3K/Akt和ERK1/2 MAPK通路,而其中的ERK1/2 MAPK通路與細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)增加密切相關(guān);最后,通過細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)表明Cc GRN-1與VEGF均可以誘導(dǎo)細(xì)胞遷移�；贑c GRN-1和VEGF在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面具有很大的共性,我們認(rèn)為Cc GRN-1作為一種海洋生物來(lái)源的多肽,對(duì)某些特殊疾病或環(huán)境造成的傷口難愈合情況可能具有良好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：水母 觸手提取物 多肽生長(zhǎng)因子 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 促增殖活性 信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R915
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 縮略詞表 Abbreviations14-16
• 前言16-19
• 第一部分 發(fā)形霞水母觸手提取物的生物學(xué)活性研究19-43
• 一、前言19-21
• 二、材料和方法21-28
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-41
• 四、討論41-43
• 第二部分 發(fā)形霞水母來(lái)源多肽生長(zhǎng)因子的生物學(xué)活性研究43-71
• 一、前言43-44
• 二、材料和方法44-52
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-69
• 四、討論69-71
• 全文總結(jié)71-72
• 綜述72-78
• 參考文獻(xiàn)77-78
• 參考文獻(xiàn)78-84
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說(shuō)明84-87
• 致謝87

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本文編號(hào)：1029469