本文關(guān)鍵詞：氯碘喹啉對(duì)細(xì)胞金屬離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用研究

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【摘要】：礦質(zhì)元素是生物體生存所必需的重要基礎(chǔ)物質(zhì)之一,構(gòu)成細(xì)胞組織成分,調(diào)節(jié)生理功能發(fā)揮重要作用。然而人體內(nèi)必需金屬離子失衡或壞境有毒金屬離子的侵入將導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生,如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等。氯碘喹啉(Clioquinol,CQ),最早用于治療瘧疾,但因產(chǎn)生一些副作用,如視網(wǎng)膜病變、心臟病等,被某些地區(qū)禁止使用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)該藥具有降低金屬離子在中樞系統(tǒng)的富集,對(duì)神經(jīng)退行性疾病有一定的治療作用,重新引起了人們的重視,但其中的分子機(jī)制并不清楚。本文利用金屬組的研究方法以及模式生物酵母(S.cerevisiae)研究了CQ對(duì)胞內(nèi)金屬離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控的分子機(jī)制。首先,通過(guò)ICP-AES方法檢測(cè)了CQ對(duì)小鼠不同組織內(nèi)Zn2+、Fe3+、Cu2+、K+、Mg2+和Ca2+含量的影響,數(shù)據(jù)顯示Zn2+和Fe3+含量降低,而Ca2+含量升高。酵母中亦如此。其中鈣離子參與神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放,在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中也有重要生物學(xué)意義,所以深入研究了CQ對(duì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)節(jié)機(jī)制。利用pmc1△、vcx1△、pmr1△、cch1△多種鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷菌株的藥物敏感分析及離子檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)CQ處理,抑制細(xì)胞Zn2+、Fe3+吸收,但不同于EDTA的作用,促進(jìn)了Ca2+富集,并與處理濃度成正相關(guān)性;但PMR1缺失突變后胞內(nèi)鈣離子含量基本不受CQ的影響,推測(cè)PMR1p可能是CQ的靶蛋白或CQ抑制了PMR1的表達(dá)。其次,用RT-PCR檢測(cè)和熒光顯微鏡觀察CQ對(duì)PMR1轉(zhuǎn)錄和PMR1-GFP表達(dá)的影響,結(jié)果表明CQ下調(diào)了PMR1的表達(dá)。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)CQ的抑制作用依賴于轉(zhuǎn)錄因子CRZ1。隨后將PMR1啟動(dòng)子區(qū)域(-1000~0bp)上含不同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域的三個(gè)片段分別插入熒光素酶標(biāo)記基因(Ycplac33-Rluc)的起始密碼子前,熒光素酶檢測(cè)表明CQ對(duì)轉(zhuǎn)錄因子CRZ1p與PMR1啟動(dòng)子-918bp(b段)區(qū)域的結(jié)合起到調(diào)控作用而抑制PMR1表達(dá);同時(shí)通過(guò)RT-PCR及CRZ1-GFP的檢測(cè)也證實(shí)了CQ抑制了CRZ1p的表達(dá)水平。PMR1p是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體膜鈣離子泵ATPase,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)鈣離子儲(chǔ)存的主要場(chǎng)所,其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激息息相關(guān)。所以,最后檢測(cè)了CQ對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CQ與DTT引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制不同,藥物通過(guò)抑制PMR1的表達(dá)進(jìn)而改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)來(lái)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。綜上所述,CQ抑制了轉(zhuǎn)錄因子CRZ1的表達(dá),同時(shí)抑制CRZ1p與PMR1啟動(dòng)子的結(jié)合,從而抑制了PMR1的轉(zhuǎn)錄,抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體對(duì)胞內(nèi)鈣離子的利用及外排,促進(jìn)了液泡對(duì)鈣離子的吸收,導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子升高。
【關(guān)鍵詞】：氯碘喹啉 釀酒酵母 離子穩(wěn)態(tài) 調(diào)控機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-9
• 縮略語(yǔ)9-10
• 1. 緒論10-19
• 1.1 喹啉及衍生物研究背景10-12
• 1.2 金屬組學(xué)在疾病研究中的應(yīng)用12-17
• 1.3 課題研究意義與內(nèi)容17-19
• 2. 氯碘喹啉對(duì)小鼠不同組織內(nèi)金屬離子含量的影響19-22
• 2.1 材料與試劑19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器19
• 2.3 試驗(yàn)方法19-20
• 2.4 結(jié)果與分析20-22
• 3. 氯碘喹啉對(duì)釀酒酵母胞內(nèi)陽(yáng)離子穩(wěn)態(tài)的影響22-32
• 3.1 CQ顯著抑制酵母菌株的生長(zhǎng)22-24
• 3.2 CQ影響了細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)離子水平24-26
• 3.3 野生型和離子轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷菌株的CQ敏感表型分析26-28
• 3.4 陽(yáng)離子的添加對(duì)酵母菌株CQ敏感表型的影響28-29
• 3.5 離子轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷菌株的離子檢測(cè)29-31
• 3.6 小結(jié)與討論31-32
• 4. CQ影響酵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量的分子機(jī)制32-55
• 4.1 CQ對(duì)PMR1 mRNA表達(dá)量的影響32-37
• 4.2 CQ 對(duì) PMR1 轉(zhuǎn)錄因子缺失突變體 PMR1 m RNA 的表達(dá)量的影響37-38
• 4.3 CQ對(duì)CRZ1 mRNA表達(dá)量的影響38-40
• 4.4 構(gòu)建YCplace33-RLUC載體40-44
• 4.5 YCplace33-Rlu-啟動(dòng)子基因的構(gòu)建44-49
• 4.6 熒光素酶表達(dá)量的檢測(cè)49-51
• 4.7 所得結(jié)論進(jìn)一步驗(yàn)證51-54
• 4.8 小結(jié)與討論54-55
• 5. CQ對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR效應(yīng)的影響55-60
• 5.1 材料與試劑55
• 5.2 儀器55
• 5.3 試驗(yàn)方法55-58
• 5.4 結(jié)果與分析58-60
• 6. 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-68
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果68-69
• 致謝69

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