本文關(guān)鍵詞：烯啶蟲(chóng)胺對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遺傳毒性研究

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【摘要】：烯啶蟲(chóng)胺是一種新煙堿殺蟲(chóng)劑,對(duì)哺乳動(dòng)物低毒,因此在農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖和家居生活等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。但最近毒理學(xué)研究表明新煙堿殺蟲(chóng)劑對(duì)非靶標(biāo)生物產(chǎn)生毒性作用,對(duì)生態(tài)環(huán)境、哺乳動(dòng)物乃至人類健康構(gòu)成潛在危害。目前烯啶蟲(chóng)胺對(duì)于非靶標(biāo)生物的毒性機(jī)制尚不清楚,未見(jiàn)烯啶蟲(chóng)胺對(duì)人細(xì)胞毒性的相關(guān)報(bào)道。采用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, hBMSCs)作為檢測(cè)體系能夠有效提高化學(xué)品安全性評(píng)價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性及與人體健康的相關(guān)性,并有利于提高測(cè)試效率和確定毒性機(jī)制。本研究的目的是利用體外hBMSCs培養(yǎng)方法,探討烯啶蟲(chóng)胺的遺傳毒性和作用機(jī)制,并確定早期遺傳毒性生物標(biāo)志物。烯啶蟲(chóng)胺以0-2500 μg/mL暴露hBMSCs,采用水溶性甲瓚法檢測(cè)細(xì)胞存活率,結(jié)果表明細(xì)胞存活率和增殖沒(méi)有顯著的抑制作用。用體外微核實(shí)驗(yàn)檢測(cè)烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs的DNA損傷,用Annexin-FITC法檢測(cè)烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs的細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示烯啶蟲(chóng)胺暴露導(dǎo)致細(xì)胞微核率和核芽升高,具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。烯啶蟲(chóng)胺濃度大于125 μg/mL時(shí)細(xì)胞微核率顯著高于陰性對(duì)照組,該濃度低于產(chǎn)生凋亡小體的濃度,從而排除凋亡小體對(duì)微核計(jì)數(shù)的干擾。闡明烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs造成DNA損傷作用,具有潛在的遺傳毒性。通過(guò)活性氧、總抗氧化能力和超氧岐化酶檢測(cè)烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs氧化應(yīng)激水平,發(fā)現(xiàn)暴露濃度大于250 μg/mL時(shí)活性氧含量顯著增加,總抗氧化能力下降,超氧岐化酶活力異常。此外,通過(guò)堿性磷酸酶測(cè)定和茜素紅染色評(píng)估烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs誘導(dǎo)成骨分化能力,結(jié)果表明堿性磷酸酶活性顯著下降并且茜素紅對(duì)鈣化結(jié)節(jié)染色下降,烯啶蟲(chóng)胺暴露對(duì)hBMSCs成骨分化產(chǎn)生抑制作用。進(jìn)一步,利用熒光定量PCR方法檢測(cè)烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs DNA損傷應(yīng)答通路基因表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATM、ATR、 p53、p21、Gadd45a、H2AX和Bax基因發(fā)生差異表達(dá)。綜上,本研究發(fā)現(xiàn)烯啶蟲(chóng)胺對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有遺傳毒性損傷,DNA損傷應(yīng)答通路上的ATM和p53基因?qū)NA損傷進(jìn)行調(diào)控。DNA損傷使細(xì)胞內(nèi)活性氧升高,總抗氧化能力下降,導(dǎo)致細(xì)胞氧化還原體系失衡,影響細(xì)胞成骨分化。研究結(jié)果提示hBMSCs模型是一種良好的遺傳毒性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法,利用早期生物標(biāo)志物,有助于預(yù)測(cè)和評(píng)估外源化學(xué)物對(duì)于人體的潛在危害。
【關(guān)鍵詞】：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 遺傳毒性 烯啶蟲(chóng)胺 新煙堿類殺蟲(chóng)劑 毒性機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R99
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引言10-11
• 1 緒論11-25
• 1.1 新煙堿類殺蟲(chóng)劑11-14
• 1.1.1 新煙堿類殺蟲(chóng)劑對(duì)昆蟲(chóng)的毒性效應(yīng)與作用機(jī)制11-12
• 1.1.2 新煙堿類殺蟲(chóng)劑對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性效應(yīng)12
• 1.1.3 一種典型新煙堿類殺蟲(chóng)劑—烯啶蟲(chóng)胺12-14
• 1.2 化學(xué)品毒性體外測(cè)試方法14-20
• 1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法的發(fā)展14-18
• 1.2.2 干細(xì)胞在體外毒性檢測(cè)中的應(yīng)用18-19
• 1.2.3 遺傳毒性體外測(cè)試方法19-20
• 1.3 毒性作用模式與毒性作用機(jī)制20-24
• 1.3.1 毒性作用模式21-22
• 1.3.2 遺傳毒性作用機(jī)制22-24
• 1.4 本文主要研究思路24-25
• 2 材料與方法25-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)試劑25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器26
• 2.3 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)26-29
• 2.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)29
• 2.5 水溶性甲瓚法(WST-8)檢測(cè)細(xì)胞存活率29
• 2.6 鼠肝微粒體酶(S9)體外活化系統(tǒng)制備29
• 2.7 細(xì)胞暴露29-30
• 2.8 微核實(shí)驗(yàn)30
• 2.9 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)30
• 2.10 氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)30-31
• 2.11 hBMSCs誘導(dǎo)成骨分化31
• 2.12 細(xì)胞總RNA提取31-32
• 2.13 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA32
• 2.14 Realtime-qPCR檢測(cè)DNA損傷應(yīng)答通路關(guān)鍵基因表達(dá)32-34
• 2.15 數(shù)據(jù)分析34-35
• 3 遺傳毒性測(cè)試陽(yáng)性對(duì)照物——甲磺酸甲酯對(duì)hBMSCs的毒性35-44
• 3.1 甲磺酸甲酯對(duì)hBMSCs的細(xì)胞毒性和遺傳毒性35-38
• 3.1.1 甲磺酸甲酯對(duì)hBMSCs的細(xì)胞毒性36
• 3.1.2 甲磺酸甲酯對(duì)hBMSCs的遺傳毒性36-38
• 3.2 甲磺酸甲酯對(duì)hBMSCs DNA損傷通路關(guān)鍵基因的影響38-43
• 3.2.1 引物驗(yàn)證39
• 3.2.2 MMS對(duì)hBMSCs的DNA損傷通路關(guān)鍵基因的影響39-43
• 3.3 小結(jié)43-44
• 4 烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs的遺傳毒性效應(yīng)44-60
• 4.1 烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs的細(xì)胞毒性44-46
• 4.1.1 烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs的細(xì)胞存活率的影響44-45
• 4.1.2 烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs凋亡率的影響45-46
• 4.2 烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs的遺傳毒性46-53
• 4.2.1 烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs的遺傳毒性47-48
• 4.2.2 烯啶蟲(chóng)胺經(jīng)體外活化代謝后對(duì)hBMSCs的遺傳毒性48-50
• 4.2.3 農(nóng)用烯啶蟲(chóng)胺混劑對(duì)hBMSCs的遺傳毒性50-53
• 4.3 烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBSMCs氧化應(yīng)激的影響53-57
• 4.3.1 烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs活性氧的影響53-54
• 4.3.2 烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs總抗氧化能力的影響54-56
• 4.3.3 烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs超氧岐化酶的影響56-57
• 4.4 烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs的成骨分化的影響57-59
• 4.5 小結(jié)59-60
• 5 烯啶蟲(chóng)胺對(duì)hBMSCs的DNA損傷通路上關(guān)鍵基因表達(dá)的影響60-66
• 5.1 ATM和ATR基因表達(dá)變化60-61
• 5.2 p53和Bax基因表達(dá)變化61-62
• 5.3 p21和Gadd45a基因表達(dá)變化62-63
• 5.4 H2AX基因表達(dá)變化63-65
• 5.5 小結(jié)65-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-73
• 附錄A hBMSCs表面分子鑒定73-74
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況74-75
• 致謝75-76

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1027520