本文關(guān)鍵詞：益氣活血中藥配伍聯(lián)合雙抗抗血小板的作用與機制研究

  更多相關(guān)文章： 益氣活血 西洋參莖葉總皂甙 三七總皂苷 血小板 內(nèi)皮 胃粘膜

【摘要】：阿司匹林(Aspirin, ASA)和氯吡格雷(Clopidogrel.CLP)組成的雙聯(lián)抗血小板(Dual antiplatelet therapy)是急性冠脈綜合癥(Acute coronary syndrome,ACS)患者經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(Percutaneous coronary intervention, PCI)后一年內(nèi)的常規(guī)治療方案。ASA不可逆地乙酰化血小板環(huán)氧化酶-1(Cyclooxygenase-1, COX-1),減少血栓素(Thromboxane, TXA2)產(chǎn)生,抑制花生四烯酸(Arachidonic acid, AA)誘導(dǎo)的血小板活化,但對凝血酶、二磷酸腺苷(Adenosinediphosphate, ADP)等其他誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板活化的抑制作用較弱；CLP特異性地、不可逆地阻斷血小板P2Y12受體,抑制其下游PI3K/Akt通路,抑制血小板聚集。與單用ASA或CLP相比,雙抗具有更好的抗血小板作用,但ACS患者PCI后即使長期服用雙抗,1年內(nèi)血栓事件發(fā)生率仍達7.4%-16.5%；同時,仍有1.3%的患者在30天內(nèi)出現(xiàn)消化道出血。因此,如何有效抑制血小板活化,同時又可減少雙抗引起的胃粘膜損傷,是目前面臨的挑戰(zhàn)。內(nèi)皮-血小板粘附是動脈血栓形成的始動環(huán)節(jié)。內(nèi)皮損傷可誘導(dǎo)血小板粘附活化,活化的血小板又可加重內(nèi)皮損傷,促進血栓形成。ASA抑制血管局部COX,可導(dǎo)致?lián)p傷內(nèi)皮的修復(fù)延遲；CLP可抑制PI3K/Akt通路,促進內(nèi)皮細胞凋亡。雙抗是否會影響內(nèi)皮細胞損傷誘導(dǎo)的血小板粘附和活化,目前尚缺乏報道。胃粘膜上皮細胞COX-1和COX-2均可介導(dǎo)前列腺素E2 (Prostaglandin E2, PGE2)和前列環(huán)素(Prostaglandin I2, Prostacyclin, PGI2)的合成。PGE2促進胃粘膜上皮細胞增生,增強胃粘膜上皮細胞連接,維持胃粘膜上皮細胞正常的通透性；PGI2改善局部血液循環(huán),促進損傷胃粘膜的修復(fù)。ASA和CLP均可直接誘導(dǎo)胃粘膜上皮細胞凋亡和通透性升高。GTP-結(jié)合蛋白RhoA對細胞間連接蛋白的表達和細胞通透性的維持具有重要作用,PI3K/Akt通路作為RhoA的上游通路,可減輕RhoA介導(dǎo)的細胞通透性升高。雙抗對胃粘膜上皮細胞的損傷機制是否與胃粘膜上皮細胞COX/前列腺素(Prostaglandins, PGs)通路和PI3K/Akt/RhoA通路有關(guān),亦未見有研究報道。西洋參和三七配伍是益氣活血的常用配伍之一,被廣泛應(yīng)用于冠心病等血栓性疾病的治療。既往研究證實,益氣活血中藥聯(lián)合雙抗和單用雙抗相比,可顯著降低PCI術(shù)后患者的血栓事件發(fā)生率,且不增加出血風(fēng)險。西洋參莖葉總皂苷(Panax quinquefolium saponin, PQS)作為上市中成藥,在國內(nèi)用于冠心病治療近20年,臨床試驗證明,PQS可顯著減輕冠心病心絞痛癥狀和缺血心電圖改變。實驗研究顯示,PQS可上調(diào)內(nèi)皮細胞P13K/Akt通路蛋白表達,減輕內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷。PQS聯(lián)合雙抗可以降低心肌梗死大鼠血清內(nèi)皮素(Endothelin-1, ET-1)濃度,升高血清一氧化氮(Nitric oxide, NO)濃度。三七總皂苷(Panax notoginseng saponin, PNS)可減輕內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷,抑制ADP或膠原誘導(dǎo)的血小板活化。PNS聯(lián)合雙抗與單用雙抗相比,可以顯著降低PCI術(shù)后1年內(nèi)心血管事件發(fā)生率,但目前尚缺乏關(guān)于PNS與ASA在抗血小板方面的比較研究。既往研究證實PNS可上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)內(nèi)PI3K/Akt/GSK-3β通路蛋白表達,減輕細胞凋亡。PNS對雙抗誘導(dǎo)的胃粘膜上皮細胞凋亡和通透性升高有何作用,其機制是否也涉及PI3K/Akt/RhoA通路和COX通路,以往尚缺乏研究。圍繞以上問題,本研究提出如下假說：(1)在雙抗基礎(chǔ)上聯(lián)用PQS或PNS,可進一步抑制內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)的血小板粘附和活化；(2)PQS聯(lián)合雙抗可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路發(fā)揮內(nèi)皮細胞保護作用；(3)PNS可抑制內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)的血小板活化,機理可能涉及對內(nèi)皮細胞和血小板COX通路的抑制；(4)PNS通過調(diào)節(jié)胃粘膜上皮細胞COX/PGs、PI3K/Akt/RhoA和PI3K/Akt/GSK-3β通路,減輕雙抗誘導(dǎo)的胃粘膜上皮細胞凋亡和通透性升高。針對以上假說,本研究進行三部分研究：實驗一益氣活血中藥有效部位聯(lián)合雙抗對內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)血小板粘附的影響目的：觀察PQS+雙抗、PNS+雙抗及PQS與PNS配伍聯(lián)合雙抗對內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)的血小板粘附的作用,并從PI3K/Akt、COX-2/6-keto-PGFlα和COX-1/TXB:通路探討其機制。方法：體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC),加入氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)(終濃度：80 mg/L)干預(yù)HUVEC 16h,建立HUVEC損傷模型。損傷的HUVEC隨機分為模型組、雙抗組(ASA15μg/ml+氯吡格雷10μg/ml)、PQS (160μg/ml)+雙抗組,PNS (160μg/ml)+雙抗組,PQS (160μg/ml)+PNS (160μg/ml)+雙抗組及P13K特異性抑制劑(LY294002,30μg/ml)+PQS+雙抗組,同時設(shè)空白組作為對照。造模16h后,HUVEC中加入靜息血小板共同孵育5min。流式細胞術(shù)檢測HUVEC凋亡率、血小板粘附程度和血小板CD62p表達；放免法檢測HUVEC上清液中6-keto-PGFla和TXB2濃度；Western-blot檢測HUVEC和血小板中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、COX-1、COX-2的蛋白表達。結(jié)果：與空白組比較,模型組HUVEC凋亡率、血小板粘附、血小板CD62p表達均升高(P0.05),細胞培養(yǎng)上清液中6-keto-PGFla濃度、TXB2濃度均升高(P0.05),HUVEC中p-Akt蛋白表達降低、COX-2蛋白表達升高(P0.05),血小板中p-Akt蛋白表達升高(P0.05)。與模型組比較,雙抗組血小板粘附、血小板CD62p表達均降低(P0.05),HUVEC凋亡率無顯著變化(P0.05),細胞培養(yǎng)上清液中6-keto-PGFla濃度、TXB2濃度均降低(P0.05),HUVEC中COX-2蛋白表達降低(P0.05), p-Akt蛋白表達無明顯變化(P0.05),血小板中p-Akt蛋白表達降低(P0.05)。與雙抗組比較,PQS+雙抗組血小板粘附、HUVEC凋亡率均降低(P0.05),血小板CD62p表達無明顯變化(P0.05),上清液6-keto-PGFla濃度升高(P0.05),HUVEC p-Akt蛋白表達升高(P0.05)；加入LY294002后,HUVEC凋亡率、血小板粘附均升高(P0.05)。與雙抗組相比,PNS+雙抗組血小板粘附.HUVEC凋亡率均降低(P0.05),血小板CD62P表達無明顯改變(P0.05),上清液6-keto-PGFla濃度升高(P0.05),HUVEC中COX-2蛋白表達升高(P0.05),血小板COX-1蛋白表達降低(P0.05)。與PQS+雙抗組比較,PQS+PNS+雙抗組內(nèi)皮細胞凋亡率、血小板粘附和CD62p表達均降低(P0.05),血小板COX-1蛋白表達降低(P0.05)。與PNS+雙抗組比較,PQS+PNS+雙抗組內(nèi)皮細胞凋亡率和血小板粘附均降低(P0.05), CD62p表達無明顯改變(P0.05)。結(jié)論：PQS聯(lián)合雙抗或PNS聯(lián)合雙抗均可抑制內(nèi)皮細胞凋亡和內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)的血小板粘附,PQS與PNS配伍聯(lián)合雙抗,效果更顯著,其機制涉及對內(nèi)皮細胞PI3K/Akt通路、C0X-2/PGL通路的促進和對血小板PI3K/Akt通路、C0X-l/TXA2通路的抑制。實驗二：三七總皂苷對內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)血小板粘附的作用與機制研究目的：觀察PNS和ASA對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡及凋亡內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)的血小板活化和粘附的作用,并從COX通路探討其機制。方法：體外培養(yǎng)HUVEC,加入ox-LDL(終濃度：80 mg/L)干預(yù)HUVEC 16h建立HUVEC損傷模型。損傷的HUVEC隨機分為模型組,ASA組(15μg/ml),PNS組(160μg/ml),同時設(shè)置空白組作為對照。造模16h后,HUVEC中加入靜息血小板共同孵育5min。流式細胞術(shù)檢測HUVEC凋亡率、血小板粘附和血小板CD62p表達,放免法檢測細胞培養(yǎng)上清液6-keto-PGFla和TXB2水平,Western-blot檢測HUVEC和血小板中COX-1、COX-2蛋白表達。結(jié)果：與空白組相比,模型組HUVEC凋亡率、血小板粘附、血小板CD62p表達均顯著升高(P0.05),細胞培養(yǎng)上清液6-keto-PGF1a和TXB2水平均升高(P0.05)。與模型組比較,ASA組HUVEC凋亡率升高,血小板粘附和血小板CD62p表達均降低(P0.05),細胞培養(yǎng)上清液6-keto-PGF1a和TXB：水平均降低(P0.05)。與ASA組比較,PNS組HUVEC凋亡率和血小板粘附均顯著降低(P0.05),細胞培養(yǎng)上清液6-keto-PGF1a水平升高(P0.05), TXB2水平降低(P0.05),HUVEC中COX-2蛋白表達升高(P0.05),血小板COX-1蛋白表達降低(P0.05)。結(jié)論：ASA與PNS均可抑制內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)的血小板粘附與活化,其中與ASA相比,PNS抑制血小板粘附的作用更顯著,其機制涉及PNS對血小板COX-1/TXA2通路的抑制和對內(nèi)皮細胞COX-2/PGI2通路的促進作用。實驗三：三七總皂苷對雙抗引起的胃粘膜上皮細胞損傷的影響目的：觀察PNS對雙抗誘導(dǎo)的胃粘膜上皮細胞凋亡和通透性升高的影響,并從COX通路和PI3K/Akt通路探討其作用機制。方法：體外培養(yǎng)人胃粘膜上皮細胞(GES-1),隨機分為空白組、雙抗組、PNS+雙抗組.LY294002+PNS+雙抗組。流式細胞術(shù)檢測GES-1凋亡率,酶標儀測定GES-1細胞通透性,放免法檢測GES-1細胞培養(yǎng)上清液PGE2、6-keto-PGFla濃度,ELISA法檢測GES-1細胞培養(yǎng)上清液血管內(nèi)皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)濃度。Western-blot檢測GES-1中COX-1、COX-2、PI3K、 p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK-3β、RhoA、GTP-RhoA蛋白表達。結(jié)果：與空白組比較,雙抗組GES-1凋亡率、通透性均顯著升高(P0.05),PGE2、 6-keto-PGFla和VEGF濃度均降低(P0.05), COX-1、p-PI3K、p-Akt蛋白表達均降低(P0.05), COX-2、GTP-RhoA、GSK-3β蛋白表達均升高(P0.05)。與雙抗組比較,PNS+雙抗組GES-1凋亡率與通透性均降低(P0.05),PGE2、6-keto-PGF1 a和VEGF濃度均升高(P0.05),COX-1、p-PI3K、p-Akt蛋白表達均升高(P0.05),COX-2、GTP-RhoA、GSK-3β蛋白表達均降低(P0.05);加入LY294002后,COX-1和COX-2蛋白表達無影響(P0.05),GES-1凋亡率和通透性均顯著升高(P0.05),GTP-RhoA及GSK-3β蛋白表達均升高(P0.05)。結(jié)論：PNS可以減輕雙抗對胃粘膜上皮細胞中COX/PG通路的抑制,減輕雙抗誘導(dǎo)的胃粘膜上皮細胞凋亡和通透性升高,機制涉及對胃粘膜上皮細胞PI3K/Akt/GSK-3β-VEGF-RhoA通路的調(diào)節(jié)。
【關(guān)鍵詞】：益氣活血 西洋參莖葉總皂甙 三七總皂苷 血小板 內(nèi)皮 胃粘膜
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要5-10
• Abstract10-13
• 英文縮略詞表13-15
• 第一部分 文獻綜述15-41
• 綜述一 中西醫(yī)結(jié)合抗血小板治療進展15-30
• 綜述二 阿司匹林、氯吡格雷致胃粘膜損傷機理與中醫(yī)藥防治研究進展30-34
• 參考文獻34-41
• 前言41-48
• 參考文獻43-48
• 第二部分 實驗研究48-93
• 實驗一 益氣活血中藥有效部位聯(lián)合雙抗對內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)血小板粘附的影響48-69
• 材料和方法48-52
• 結(jié)果52-58
• 討論58-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻64-69
• 實驗二 三七總皂苷對內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)血小板粘附的作用與機制研究69-80
• 材料和方法69-70
• 結(jié)果70-75
• 討論75-77
• 結(jié)論77-78
• 參考文獻78-80
• 實驗三 三七總皂苷對雙抗引起的胃粘膜上皮細胞損傷的影響80-93
• 材料和方法80-82
• 結(jié)果82-86
• 討論86-89
• 結(jié)論89-90
• 參考文獻90-93
• 結(jié)論93-94
• 致謝94-95
• 個人簡歷95-96

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本文編號：1022319