本文關(guān)鍵詞：鉑—唑來(lái)膦酸配合物的抗腫瘤活性及作用機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 鉑-唑來(lái)膦酸配合物 人胃癌細(xì)胞SGC7901 細(xì)胞周期阻滯 凋亡 法尼醇

【摘要】：目的探討鉑-唑來(lái)瞵酸配合物{[Pt(en)]2ZL}對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性,并初步研究該化合物抑制人胃癌細(xì)胞SGC7901增殖的可能機(jī)制。方法運(yùn)用傳統(tǒng)MTT方法來(lái)測(cè)定{[Pt(en)]2ZL}所影響的多種腫瘤細(xì)胞存活率,以及后期加入FOH時(shí)的腫瘤細(xì)胞存活率變化。平板克隆實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè){[Pt(en)]2ZL}對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901增殖情況的影響。細(xì)胞衰老半乳糖苷酶染色與免疫熒光染色分別用來(lái)觀察此配合物引起的SGC7901衰老及微管動(dòng)態(tài)平衡方面的改變。選用適當(dāng)?shù)臒晒馊旧?PI單染、Hochest 33342/PI熒光雙染、JC-1單染、TUNEL實(shí)驗(yàn)、Annexin V/PI雙染)進(jìn)行熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞儀定量分析{[Pt(en)]2ZL}及法尼醇(FOH)的加入對(duì)SGC7901細(xì)胞周期和凋亡的影響。AO熒光染色可用于觀察此配合物引起的細(xì)胞自噬相關(guān)形態(tài)學(xué)變化。Western blot可用于半定量觀測(cè){[Pt(en)]2ZL}所引起的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(p53、p21、Cyclin D1, Cyclin E和CDK2),細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2,Bax,caspase 3,PARP及survivin),細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3以及小G蛋白家族相關(guān)蛋白(Ras和RhoA)的表達(dá)水平的變化。結(jié)果{[Pt(en)]2ZL}對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有良好的抗腫瘤活性(如：對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901和MGC803的IC50值分別為25.15±0.75和38.52±3.00μM),且目前對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901最為顯著,并觀察到胃癌細(xì)胞在藥物作用后會(huì)出現(xiàn)衰老及微管動(dòng)態(tài)平衡形態(tài)及功能方面的改變,并進(jìn)一步檢測(cè)到其細(xì)胞周期阻滯在G1/S期(99.99%),且細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白(p53.p21.Cyclin E和CDK2表達(dá)水平上調(diào),Cyclin D1的表達(dá)水平下調(diào))的表達(dá)水平也相應(yīng)改變。與此同時(shí),在熒光染色下SGC7901也出現(xiàn)了明顯的凋亡形態(tài)和功能變化,而Annexin V/PI雙染更能定量觀測(cè)到凋亡發(fā)生的比例(早凋和晚凋的比例分別可升至20.5%和25.3%),.且細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2,caspase 3酶原,PARP酶原及survivin表達(dá)水平下調(diào),Bax及剪切后PARP表達(dá)水平上調(diào))的表達(dá)水平亦發(fā)生變化。而FOH的加入,可以削弱{[Pt(en)]2ZL}引起的細(xì)胞增殖抑制(IC50值升至84.43±4.04μM)、細(xì)胞周期阻滯(G2/M期升至9.17±1.12%)和凋亡(早凋和晚凋的比例分別降至6.12±3.51%和5.36±0.53%),并引起小G蛋白家族(Ras和RhoA酶原表達(dá)水平下調(diào),非異戊烯化的Ras和RhoA表達(dá)水平上調(diào))的表達(dá)水平的變化。另外,AO熒光染色及LC3蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn){[Pt(en)]2ZL}可引起SGC7901發(fā)生自噬相關(guān)的形態(tài)和分子水平方面的改變。結(jié)論鉑-唑來(lái)膦酸配合物{[Pt(en)]2ZL}對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有良好的抗腫瘤活性,尤以對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901較為突出。目前的研究表明{[Pt(en)]2ZL}對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901通過(guò)細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮良好的抗增殖活性。其中G1/S期阻滯與化合物對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的p53-p21-Cyclin D支路的調(diào)節(jié)相關(guān)。而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及胞內(nèi)PARP相關(guān)凋亡活動(dòng)的激活相關(guān)。另外,FOH以及細(xì)胞自噬均有可能在{[Pt(en)]2ZL}所引起抗腫瘤活性中發(fā)揮重要作用。由此可知,{[Pt(en)]2ZL}在治療胃癌方面,可以成為一種具有優(yōu)良抗腫瘤潛力的化療藥物。
【關(guān)鍵詞】：鉑-唑來(lái)膦酸配合物 人胃癌細(xì)胞SGC7901 細(xì)胞周期阻滯 凋亡 法尼醇
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R96
【目錄】：

• 中英文對(duì)照表8-10
• 中文摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 前言14-20
• 參考文獻(xiàn)17-20
• 第一部分 鉑-唑來(lái)膦酸配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖影響20-32
• 引言20
• 材料與方法20
• 1 材料20-22
• 1.1 細(xì)胞株與鉑-唑來(lái)膦酸配合物20
• 1.2 儀器20-21
• 1.3 試劑21
• 1.4 常用緩沖液配制21-22
• 2 實(shí)驗(yàn)方法22-24
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理22-23
• 2.2 細(xì)胞存活率的測(cè)定23
• 2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)23-24
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理24
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-29
• 3.1 {[Pt(en)]_2ZL}對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響24-27
• 3.2 {[Pt(en)]_2ZL}對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901的細(xì)胞毒性研究27-28
• 3.3 {[Pt(en)]_2ZL}對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901形成細(xì)胞克隆能力的影響28-29
• 討論29-30
• 結(jié)論30-31
• 參考文獻(xiàn)31-32
• 第二部分 鉑-唑來(lái)膦酸配合物對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901周期的影響32-48
• 引言32-33
• 材料與方法33
• 1 材料33-36
• 1.1 細(xì)胞株(參見(jiàn)第一部分)33
• 1.2 儀器33-34
• 1.3 試劑34
• 1.4 常用緩沖液的配制34-36
• 2 實(shí)驗(yàn)方法36-41
• 2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布36-37
• 2.2 細(xì)胞衰老半乳糖苷酶染色37
• 2.3 免疫熒光染色觀測(cè)微管結(jié)構(gòu)37
• 2.4 Western Blot法37-41
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)第一部分)41
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-45
• 3.1 {[Pt(en)]_2ZL}對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞周期分布的影響41-42
• 3.2 {[Pt(en)]_2ZL}對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901衰老的影響42-43
• 3.3 {[Pt(en)]_2ZL}對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901的微管動(dòng)態(tài)平衡的影響43
• 3.4 {[Pt(en)]_2ZL}影響人胃癌細(xì)胞SGC7901內(nèi)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)43-45
• 討論45-46
• 結(jié)論46
• 參考文獻(xiàn)46-48
• 第三部分 鉑-唑來(lái)膦酸配合物對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡的影響48-62
• 引言48-49
• 材料與方法49
• 1 材料49-50
• 1.1 細(xì)胞株(參見(jiàn)第一部分)49
• 1.2 儀器(參見(jiàn)第二部分)49
• 1.3 試劑49-50
• 1.4 常用緩沖液的配制50
• 2 實(shí)驗(yàn)方法50-52
• 2.1 Hoechst 33342/PI雙染50-51
• 2.2 線粒體膜電位檢測(cè)51
• 2.3 TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡51
• 2.4 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)51-52
• 2.5 Western Blot法(實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)第二部分)52
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)第一部分)52
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-58
• 3.1 Hoechst/PI雙染對(duì)細(xì)胞凋亡形態(tài)的評(píng)價(jià)52-53
• 3.2 {[Pt(en)]_2ZL}對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901線粒體膜電位的影響53-54
• 3.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡54-55
• 3.4 Annxin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)盒檢測(cè)凋亡發(fā)生率55-56
• 3.5 {[Pt(en)]_2ZL}影響人胃癌細(xì)胞SGC7901內(nèi)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)56-58
• 討論58-60
• 結(jié)論60
• 參考文獻(xiàn)60-62
• 第四部分 鉑-唑來(lái)膦酸配合物對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901中甲羥戊酸途徑的影響62-73
• 引言62
• 材料與方法62
• 1 材料62-63
• 1.1 細(xì)胞株(參見(jiàn)第一部分)63
• 1.2 儀器(參見(jiàn)第二部分)63
• 1.3 試劑63
• 1.4 常用緩沖液的配制63
• 2 實(shí)驗(yàn)方法63
• 2.1 FOH和GGOH對(duì){[Pt(en)]_2ZL}引起的人胃癌細(xì)胞SGC7901存活率的影響(實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)第一部分)63
• 2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布(實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)第二部分)63
• 2.3 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)(實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)第三部分)63
• 2.4 Western Blot法(實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)第二部分)63
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)第一部分)63
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果63-69
• 3.1 FOH和GGOH對(duì){[Pt(en)]_2ZL}引起的人胃癌細(xì)胞SGC7901存活率的影響63-65
• 3.2 FOH對(duì){[Pt(en)]_2ZL}引起的人胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞周期阻滯的影響65
• 3.3 FOH對(duì){[Pt(en)]_2ZL}引起的人胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞凋亡的影響65-67
• 3.4 FOH對(duì){[Pt(en)]_2ZL}引起的人胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化的影響67-68
• 3.5 {[Pt(en)]_2ZL}可影響人胃癌細(xì)胞SGC7901內(nèi)小G蛋白家族中Ras和RhoA蛋白的表達(dá)水平68-69
• 討論69-71
• 結(jié)論71
• 參考文獻(xiàn)71-73
• 第五部分 鉑-唑來(lái)膦酸配合物對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901中自噬途徑的影響73-79
• 引言73
• 材料與方法73
• 1 材料73-74
• 1.1 細(xì)胞株(參見(jiàn)第一部分)73
• 1.2 儀器(參見(jiàn)第二部分)73
• 1.3 試劑73-74
• 1.4 常用緩沖液的配制74
• 2 實(shí)驗(yàn)方法74
• 2.1 AO熒光染色74
• 2.2 Western Blot法(實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)第二部分)74
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)第一部分)74
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果74-76
• 3.1 {[Pt(en)]_2ZL}對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901自噬的影響74-75
• 3.2 {[Pt(en)]_2ZL}對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)水平的影響75-76
• 討論76-77
• 結(jié)論77
• 參考文獻(xiàn)77-79
• 綜述79-89
• 參考文獻(xiàn)85-89
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況89-90
• 致謝90-91

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1014953