發(fā)布時間：2017-09-17 03:33

  本文關(guān)鍵詞：聽神經(jīng)病譜系障礙基因突變篩查及NELL2基因在出生后小鼠耳蝸的表達研究

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【摘要】：第一部分常染色體顯性遺傳性聽神經(jīng)病譜系障礙家系鑒定及基因篩查 目的：針對本課題組收集到的一個聽神經(jīng)病譜系障礙（ANSD）家系進行臨床聽力學檢查及相應系統(tǒng)檢查，明確發(fā)病特點及分析遺傳學特點，并對該家系進行聾病基因篩查以期明確致病基因。 方法：該家系4代共24人作為研究對象，進行ABR、EOAE、言語分辨率、電子耳鏡、聲導抗測聽、顳骨薄層CT及內(nèi)聽道MRI等檢查，并詳細查體及詢問病史排除系統(tǒng)性疾病。在確定遺傳特點的基礎上，對已知聾病基因進行篩查，采集受試者外周靜脈血提取基因組DNA，應用在線引物設計軟件Primers進行引物設計，采用直接測序法對已知ANSD相關(guān)基因進行測序，使用DNAMan軟件對序列進行比對分析。在前述實驗基礎上，進行全基因組外顯子測序，首先采集兩名患者及一名正常家系成員行全外顯子測序，對初篩基因與NCBI基因庫數(shù)據(jù)進行表型及功能鑒定排除與ANSD無關(guān)聯(lián)的基因突變，初步確定可能致病基因，再將家系所有患者樣本與前述初篩樣本進行連鎖分析，最終確定候選基因。 結(jié)果：該家系24人中有4人符合非綜合征型ANSD診斷，連續(xù)三代發(fā)病，男女發(fā)病比例均等，符合常染色體顯性遺傳疾病特點。對家系中全部患者及部分聽力正常成員完成ANSD相關(guān)的常染色體顯性遺傳基因DIAPH3、常染色體隱性遺傳基因OTOF、PJVK及非綜合征型耳聾致病基因GJB2、GJB3基因外顯子及線粒體DNA12SrRNA1494、1555位點的測序分析，均未發(fā)現(xiàn)可疑致病突變。經(jīng)全基因組外顯子測序，該家系中初篩樣本中檢出堿基突變260個，經(jīng)與家系中健康成員比對，篩出可能致病突變47個，在進行表型、功能鑒定后及與家系其他成員連鎖分析后發(fā)現(xiàn)，全部患者存在NELL2基因的錯義突變（c457F），而聽力正常成員及散發(fā)ANSD患者未見該突變存在。 討論：該家系發(fā)病符合常染色體顯性遺傳性非綜合征型聽神經(jīng)病譜系障礙，，但是基因篩查未能檢測到目前已知聾病基因在該家系患病成員中發(fā)生突變，提示可能存在未知的致病基因。而全基因組外顯子測序則提示本家系全部患者存在NELL2基因的突變，經(jīng)與哈佛大學基因文庫檢索發(fā)現(xiàn)該基因在耳蝸內(nèi)有表達，高度提示可能是新的ANSD致病基因，具體功能有待于進一步研究。 第二部分NELL2基因在出生后小鼠耳蝸內(nèi)的表達研究 目的：基于ANSD家系聾病基因篩查結(jié)果，研究NELL2基因在出生后小鼠耳蝸內(nèi)表達分布規(guī)律。 方法：以C57小鼠為實驗動物，選擇出生后0天、3天、7天、14天、28天為時間節(jié)點，采用免疫熒光染色、Western Blot及RT-PCR技術(shù)，從蛋白和mRNA水平觀察小鼠出生后不同發(fā)育階段NELL2基因在耳蝸的表達與分布規(guī)律。 結(jié)果：NELL2在小鼠耳蝸有表達，并呈現(xiàn)隨著日齡遞增表達逐漸增強的趨勢。表達部位是耳蝸內(nèi)毛細胞、外毛細胞、螺旋神經(jīng)元及內(nèi)柱細胞、外柱細胞胞漿內(nèi)。P0、P3期Corti器形態(tài)不成熟，此時該區(qū)域NELL2表達不明顯，從P7開始至P28隨著Corti器的成熟，免疫熒光顯示NELL2表達呈現(xiàn)逐漸增強的趨勢，在螺旋神經(jīng)元的表達則從P0開始呈現(xiàn)持續(xù)逐漸增強的趨勢。Western Blot檢測結(jié)果顯示蛋白表達趨勢與免疫熒光染色一致，數(shù)據(jù)分析有統(tǒng)計學意義。但是RT-PCR結(jié)果顯示無論是在毛細胞還是螺旋神經(jīng)元，NELL2mRNA表達峰值均出現(xiàn)在P7，P14、P28則較之呈下降趨勢。 討論：我們的實驗證實NELL2在出生后小鼠耳蝸有表達，并且隨著小鼠日齡的增加NELL2蛋白的表達有逐漸增強的趨勢，并與Corti器形態(tài)的成熟和聽功能的形成在時間點上相一致，提示NELL2蛋白可能在Corti器的成熟及聽覺神經(jīng)細胞的功能維持上發(fā)揮作用。但是和蛋白在P0至P28期間表達持續(xù)性增高不同，RT-PCR檢測顯示NELL2mRNA表達的峰值出現(xiàn)在P7，此后則出現(xiàn)明顯的下降趨勢。提示NELL2的表達可能受到了某種或多種機制的調(diào)控，需要繼續(xù)深入研究。
【關(guān)鍵詞】：聽神經(jīng)病 顯性遺傳 基因突變 外顯子測序 基因篩查 NELL2 小鼠 耳蝸 毛細胞 蛋白 基因 表達
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R764.4
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-13
• 文獻回顧13-22
• 1 聽神經(jīng)病譜系障礙研究現(xiàn)狀13-18
• 2 NELL2 基因研究現(xiàn)狀18-22
• 第一部分 常染色體顯性遺傳性聽神經(jīng)病譜系障礙家系鑒定及基因篩查22-42
• 實驗一 聽神經(jīng)病譜系障礙家系臨床鑒定22-27
• 1 研究對象22
• 2 材料與方法22-23
• 3 結(jié)果23-25
• 4 討論25-27
• 實驗二 聽神經(jīng)病譜系障礙家系聾病基因篩查27-35
• 1 研究對象27
• 2 材料與方法27-32
• 3 結(jié)果32-33
• 4 討論33-35
• 實驗三 聽神經(jīng)病譜系障礙家系全基因組外顯子測序35-42
• 1 研究對象35
• 2 方法35-37
• 3 結(jié)果37-39
• 4 討論39-42
• 第二部分 NELL2 基因在出生后小鼠耳蝸的表達研究42-59
• 實驗一 出生后小鼠耳蝸 NELL2 免疫熒光染色42-49
• 1 材料42-43
• 2 方法43-44
• 3 結(jié)果44-47
• 4 討論47-49
• 實驗二 出生后小鼠耳蝸 NELL2 WESTERN BLOT 和 RT-PCR 檢測49-59
• 1 材料49-50
• 2 方法50-52
• 3 結(jié)果52-57
• 4 討論57-59
• 小結(jié)59-60
• 參考文獻60-66
• 個人簡歷和研究成果66-68
• 致謝68-69

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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本文編號：867045