【摘要】：目的： 通過原代培養(yǎng)獲得SD大鼠角膜上皮細胞及內皮細胞,應用MTT檢測方法研究小分子化合物J2對角膜上皮/內皮細胞的毒性作用,運用流式細胞分析技術檢測小分子化合物J2作用后角膜上皮/內皮細胞膜表面CD80分子表達的變化情況,同時應用原子力顯微鏡觀測該化合物對角膜上皮/內皮細胞膜表面超微結構的影響。建立大鼠角膜移植動物模型,在體內觀測小分子化合物J2抗移植排斥反應的效果,應用AFM觀測該化合物對角膜內皮層細胞超微結構的影響。 方法： 1、5只SPF級SD大鼠,2%戊巴比妥鈉按0.2ml/100g,腹腔麻醉。完整摘除健康大鼠眼球,取下角膜上皮/內皮組織,應用貼壁消化培養(yǎng)法培養(yǎng)角膜上皮/內皮細胞,經免疫組織化學方法鑒定。 2、按照MTT比色實驗步驟,接種細胞于96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)過夜后,加入小分子化合物J2,于不同觀測時間(10min,20min,30min, 1h,2h,4h,8h,16h,32h,48h),終止實驗,每板均設空白對照孔,選擇490nnm波長,在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值,記錄結果。所選實驗終止點結束時,對不同觀測時間的角膜上皮/內皮細胞應用透射電鏡觀察小分子化合物J2對細胞形態(tài)及細胞內各種細胞器的影響。 3、取每只SD大鼠腸系膜下靜脈血約5ml,共15只。經密度梯度離心分離法獲得單個核細胞,與角膜上皮細胞共培養(yǎng),加入20000U/L IL-2,500000U/L IFN-γ細胞因子。實驗分為三組：A組=MNCs+角膜上皮細胞+小分子化合物J2;B組=MNCs+角膜上皮細胞；C組=角膜上皮細胞(空白對照組)(各實驗組均為2ml/培養(yǎng)瓶,共5例,總共10m1)。 4、將各組處理好的細胞用流式細胞儀檢測CD80分子表達的熒光強度,首先調整細胞密度為1×106/mL,隨后進行CD80免疫熒光標記,加入羊抗鼠單克隆抗體工作液0.1mL,室溫孵育30min,洗滌1次,棄上清,加入兔抗羊FITC-IgG二抗工作液100μL,避光室溫孵育30min,經洗滌棄上清液以除去未結合的熒光二抗,上機進行檢測,并設二抗FITC的陰性對照。 5、AFM樣品的制備和觀測：將三組處理好的細胞用PBS液沖洗三遍,以三蒸水浸泡30min,以除去細胞表面殘留雜質。2.5%戊二醛溶液固定20min,超凈臺空間下自然晾干。采用氮化硅探針,100Lm掃描器,懸臂針尖曲率半徑10nm,力常數約為10mN/m。應用AFM觀測三組細胞膜表面超微結構的改變,以及小分子化合物J2對細胞膜的影響。觀測指標為Ra、Rq、Rvm、Rt。 6、以同樣的方法和步驟對角膜內皮細胞進行MTT實驗方法的檢測、流式細胞技術分析及原子力顯微鏡觀測。 7、建立大鼠同種異體角膜移植動物模型,隨機分為三組。A組為小分子化合物J2藥物實驗組,B組為CsA藥物對照組,C組安慰劑對照組。每日滴藥次數相同,為4次/d。每日裂隙燈下觀察植片情況,根據角膜新生血管評分及植片混濁評分標準判定植片存活時間。免疫組織化學方法測定植片CD80分子表達含量,AFM觀測三組角膜植片內皮層細胞超微結構的區(qū)別及變化情況。 結果： 1、經HE染色及免疫組化鑒定,本實驗第一部分已成功獲得原代培養(yǎng)的SD大鼠的角膜上皮/內皮細胞。角膜上皮細胞形態(tài)為長梭形,角膜內皮細胞則呈多角形。 2、應用MTT實驗方法,測出小分子化合物J2對角膜上皮細胞的IC50值為：10min (4.43±0.59mmol/L),20min(4.40±0.51mmol/L),30min(4.31±0.48mmoVL),1h(4.17±0. 45mmol/L),2h(4.15±0.46mmol/L),4h(4.14±0.48mmol/L),8h(4.12±0.43mmol/L), 16h(4.09±0.45mmol/L),32h(4.04±0.44mmol/L),48h(4.03±0.47mmol/L)。透射電子顯微鏡可觀察到：10mmol/L小分子化合物J2作用30min后角膜上皮細胞的形態(tài)由長梭形變?yōu)槟[脹的圓形,細胞膜表面微絨毛大量脫落,胞內細胞器可見大量空泡形成,線粒體膨脹,伴隨內嵴消失；粗面內質網的顆粒脫落消失。 3、經流式細胞分析儀檢測,A組角膜上皮細胞CD80分子熒光指數為1.944±0.237,B組為3.128±0.175,C組為1.082±0.120。經單因素方差分析,具有統計學方面的差異(F=156.307,P0.00)。經LSD-t檢驗各組之間差異均有統計學意義(P0.05)。 4、應用MTT實驗方法,測出小分子化合物J2對角膜內皮細胞的IC50值為：10min (3.20±0.33mmol/L),20min(2.97±0.28mmol/L),30min(2.88±0.26mmol/L),1h(2.68±0.25mmol/L),2h(2.59±0.26mmol/L),4h(2.58±0.14mmol/L),8h(2.53±0.17mmol/L),16h (2.45±0.11mmol/L),32h(2.44±0.21 mmol/L),48h(2.43±0.28mmol/L).透射電子顯微鏡可觀察到：10mmol/L小分子化合物J2作用30min后角膜內皮細胞的形態(tài)多邊形變?yōu)槟[脹的橢圓形,細胞膜表面微絨毛大量脫落,胞核未見,可見大量空泡。 5、經流式細胞分析儀檢測,A組角膜上皮細胞CD80分子熒光指數為2.132±0.173,B組為4.023±0.164,C組為0.985±0.118,經單因素方差分析,具有統計學方面差異(F=4989.799,P0.00)。經LSD-t檢驗各組之間差異均有統計學意義(P0.05)。 6、AFM觀察角膜上皮細胞,呈長梭形,胞核的大小在14.07μm×20.04μm左右,整個細胞的長度在54.65pm左右,其高度在580-610nm左右。角膜內皮細胞,呈多邊形,胞核的大小在17.28μm×20.43μm左右,整個細胞的長度在52.45μm左右,其高度在356nm左右�？砂l(fā)現兩種細胞的表面總體較光滑,其表面超微結構顯示顆粒狀突起。無論是角膜上皮細胞,亦或角膜內皮細胞,經單因素方差分析比較三組Ra、Rq、Rvm、Rt值,認為三組之間存在統計學方面差異。 7、三組角膜植片的存活時間為：(A)28.73±0.37d,(B)31.47±0.57d,(C)16.60±0.42d,經Log-Rank分析,三組整體比較差異有統計學意義(F=60.788,P0.00);經Log-Rank分析,控制混雜因素后對研究因素各水平間進行兩兩比較,發(fā)現A、B兩組之間無統計學差異。經AFM觀測可發(fā)現三組角膜植片內皮層細胞在超微結構上發(fā)生了改變,C組較A、B兩組發(fā)生了更為顯著的變化,A、B兩組的觀測值在某些數值上無統計學方面差異。 結論： 1、小分子化合物J2對角膜上皮/內皮細胞的毒性作用并非與時間呈線性相關性,在前1h內,IC50值下降較明顯。MTT測試的該結果,可為課題的下一步研究提供可靠的參考數據。 2、流式細胞分析檢測角膜上皮細胞經MNCs舌化,CD80分子存在高表達;經活化后的角膜上皮細胞,在小分子化合物J2作用下,CD80分子表達有所減少;在角膜內皮細胞測試上,也發(fā)現了同樣的改變,提示小分子化合物J2可能通過與CD4+T細胞膜表面的CD4D1中的CDR3-CC'袋型結構相結合,阻止TCR與MHC-Ⅱ形成復合物,進而影響共刺激分子的表達,抑制或阻斷免疫應答的活化,延緩角膜移植排斥反應的發(fā)生。 3、應用AFM可以觀測到小分子化合物J2對角膜上皮/內皮細胞膜表面超微結構的改變,為AFM對細胞膜表面的觀測提供更多更確切的表面信息,從另一層面增加小分子化合物J2對眼角膜上皮/內皮細胞影響的認識。 4、經動物模型體內實驗進一步證明小分子化合物J2具有抗角膜移植排斥的作用,但與傳統藥物CsA相比,尚不能證明其作用優(yōu)于傳統藥物,考慮為J2劑型以及藥物在角膜層代謝動力學的問題,需在下一步的研究過程中進一步改善和探討。應用AFM可以觀測到角膜內皮層細胞在體內實驗中超微結構的改變。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R779.65

【參考文獻】

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本文編號：2225396