本文關鍵詞： 失神經(jīng) α-SMA TGF-β1 CTGF 肌肉纖維化　出處：《第二軍醫(yī)大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的： 通過建立c57小鼠副神經(jīng)損傷的動物模型，研究失神經(jīng)后肌纖維組織的截面積來了解失神經(jīng)后的骨骼肌組織纖維化程度，通過纖維化相關因子的表達改變的研究，探討失神經(jīng)的胸鎖乳突肌的纖維化分子改變規(guī)律。再通過離體研究轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGFβ1)誘導成肌干細胞C2C12的纖維化轉型，探討TGFβ1對C2C12細胞纖維化轉型的作用及分子機制，以期為臨床神經(jīng)修復時機的選擇，臨床藥物干預提供實驗依據(jù)和理論依據(jù)。 方法： 1.失副神經(jīng)支配的不同時間c57小鼠模型的建立 選用健康雄性c57小鼠30只，隨機分為六個組，并按術后取材時間不同分為正常組、術后1周、2周、3周、4周、8周組，每組5只。腹腔注射4％水合氯醛(0.5ml／100g)0.3ml，麻醉成功后，分離出右側胸鎖乳突肌并充分暴露出副神經(jīng)，沿著根部剪除一段長約5mm副神經(jīng)。分別于術后1周、2周、3周、4周、8周切取胸鎖乳突肌。行MASSON染色，顯微鏡下觀察失神經(jīng)不同時間的肌肉截面積、纖維組織截面積及肌纖維直徑。 2.實時定量PCR檢測各組肌肉組織中α-平滑肌激動蛋白（α-smooth muscleactin,α-SMA）、結締組織生長因子（connective tissue growth factor， CTGF）和TGFβ1mRNA的表達水平。 利用Genebank查找出α-SMA、TGFβ1、CTGF及內(nèi)參的mRNA序列，運用Primer6軟件進行引物設計，完成引物合成。通過一系列步驟進行Real-time PCR擴增。利用軟件計算出mRNA的值 3.蛋白印跡雜交分析（Western Blot,WB）檢測肌肉組織中α-SMA、CTGF和TGFβ1的蛋白表達水平 通過制備SDS-PAGE膠、SDS-PAGE電泳、濕轉法電轉膜、膜的封閉、抗體孵育和顯色成像等Western Blot檢測步驟檢測失神經(jīng)肌肉組織的纖維化相關因子α-SMA、CTGF和TGFβ1的蛋白表達水平。 4.免疫熒光法檢測不同時間失神經(jīng)肌肉組織α-SMA、CTGF和TGFβ1陽性細胞肌纖維變化冰凍切片通過室溫復融、破膜、過夜室溫孵育一抗、隔夜后加二抗及染核等步驟進行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察圖像并采集圖像。 5.離體水平研究不同濃度的TGFβ1誘導的C2C12細胞的α-SMA的蛋白表達水平按照不同濃度的TGFβ1（0ng/ml，0.05ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，2.0ng/ml，5.0ng/ml，10ng/ml）將細胞隨機分為8組，每組3個復孔，每孔加入1.5ml含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的細胞培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM），待細胞密度生長至70%左右時，每組分別加入相應濃度的TGFβ1，誘導C2C12成肌細胞發(fā)生纖維化轉型，規(guī)定時間收集細胞。檢測不同濃度TGFβ1誘導下α-SMA的蛋白表達量的變化，明確TGFβ1誘導成肌細胞發(fā)生纖維化轉型的最合適濃度。 6.最適濃度TGFβ1誘導成肌細胞纖維化轉型中纖維化相關因子的改變以最適濃度的TGFβ1刺激C2C12細胞，刺激時間分別為0、12、24、48小時（hour, h）。在上述規(guī)定的時間節(jié)點，分別用WB和免疫熒光檢測法檢測纖維化相關因子的表達改變。 結果： 1. c57小鼠失副神經(jīng)模型建模成功。肉眼觀小鼠右側胸鎖乳突肌萎縮明顯，隨著失神經(jīng)時間的延長其形態(tài)較正常對照明顯縮小。通過masson染色切片觀察到隨著失神經(jīng)時間的增加，胸鎖乳突肌肌纖維逐漸萎縮而致肌纖維平均直徑減小，肌肉截面積縮小，而肌間隙膠原結締組織增多，最終大量占據(jù)原肌纖維所在空間。正常對照組與失神經(jīng)1周組、2周組、3周組、4周組、8周組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P0.05），說明隨著失神經(jīng)時間的延長，胸鎖乳突肌肌纖維出現(xiàn)明顯的萎縮及纖維化。而失神經(jīng)4周后肌肉纖維化趨勢減緩，與失神經(jīng)8周的兩組間肌肉截面積、膠原截面積和肌肉直徑比較未見明顯差異。上述結果說明隨失神經(jīng)時間延長肌肉萎縮纖維化逐漸加重，但失神經(jīng)4周后萎縮纖維化處于相對穩(wěn)定的平臺期，進展較緩慢。 2.實時定量PCR檢測各組組織中α-SMA、CTGF和TGFβ1mRNA的表達結果發(fā)現(xiàn)失神經(jīng)2周后α-SMA和CTGF的轉錄水平上調(diào)最明顯，TGFβ1的轉錄水平在失神經(jīng)1周后上調(diào)。此后各因子轉錄水平略有下降，但仍有較長時間較高水平的持續(xù)表達。 3.正常胸鎖乳突肌未見各纖維化相關因子蛋白表達。失神經(jīng)后1周可檢測到α-SMA和CTGF的陽性表達，到失神經(jīng)2周表達量達到高峰，此后表達量較2周下降，但仍可檢測到較高水平陽性條帶。TGFβ1的蛋白表達量在失神經(jīng)1周表達量即明顯升高，2周、3周、4周雖有下降，但仍有持續(xù)的表達。其結果同PCR結果相一致。 4.免疫熒光法檢測失神經(jīng)組織不同時間α-SMA、CTGF和TGFβ1陽性細胞的結果發(fā)現(xiàn)，正常胸鎖乳突肌未檢測到α-SMA、CTGF及TGFβ1陽性細胞。失神經(jīng)損傷后1周開始出現(xiàn)α-SMA、CTGF陽性細胞，損傷后2周陽性細胞數(shù)目明顯最多，表達定位于肌細胞胞漿及胞膜，而TGFβ1失神經(jīng)后1周表達最強最多，表達定位于肌細胞胞漿及胞膜，而且隨著時間的延長，陽性細胞數(shù)目減少，但仍維持在一個較高水平。 5.離體實驗顯示，TGFβ1能誘導C2C12成肌細胞纖維化轉型，隨著TGFβ1濃度的增高，α-SMA的表達量也逐漸增高，以TGFβ1濃度為5ng/ml時，α-SMA表達最強，但TGFβ1為10ng/ml時α-SMA的表達量則開始下降。提示TGFβ1的最佳誘導成肌細胞纖維化轉型的濃度為5ng/ml。以最適合的5ng/ml濃度的TGF-β1干預c2c12細胞后不同時間I型膠原（collagen-I）、CTGF和α-SMA蛋白水平的表達較空白對照組明顯增加。collagen-I、CTGF和α-SMA的蛋白表達在12小時即呈高表達狀態(tài)。并持續(xù)穩(wěn)定表達。 6.免疫熒光法檢測可見5.0ng/ml的TGFβ1刺激C2C12細胞12小時后，collagen-I、CTGF和α-SMA3個指標的免疫熒光表達增強，表達定位于細胞膜及細胞漿內(nèi)，持續(xù)到48小時仍無明顯減弱。 結論： 1.小鼠失神經(jīng)1-4周的胸鎖乳突肌，隨失神經(jīng)時間的延長，肌纖維萎縮纖維化逐漸加重，以4周最為明顯。但4周后處于穩(wěn)定的平臺期，纖維化進展緩慢。 2.失神經(jīng)引起肌纖維的纖維化相關因子持續(xù)高表達，而以TGFβ1表達首先達到高峰，而其下游因子CTGF及α-SMA的表達高峰明顯遲于TGFβ1。提示失神經(jīng)后首先激活TGFβ1的表達，通過級聯(lián)反應，誘使CTGF及纖維化標記物α-SMA的表達，從而產(chǎn)生肌肉失神經(jīng)萎縮、纖維化。 3.5.0ng/ml的TGFβ1為誘導小鼠成肌干細胞C2C12發(fā)生纖維化轉型的最適合誘導濃度。離體水平用該濃度刺激C2C12細胞，誘導其纖維化轉型，，在0、12、24、48h這幾個不同時間點通過WB和免疫熒光觀測TGFβ1下游的纖維化效應因子collagen-I、CTGF和α-SMA的蛋白表達和定量表達。結果表明5.0ng/ml的TGFβ1刺激C2C12細胞后，以上3項指標均呈持續(xù)高表達狀態(tài)。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R767.6

【參考文獻】

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