本文關(guān)鍵詞：體外轉(zhuǎn)染CyclinA2基因?qū)υ笫笮募〖?xì)胞增殖的影響

  更多相關(guān)文章： Cyclin A2 增殖 原代培養(yǎng) 基因轉(zhuǎn)染 心肌細(xì)胞

【摘要】：背景臨床上對(duì)心血管惡性事件的救治主要依賴于藥物控制和手術(shù)干預(yù),但是從治療效果和長(zhǎng)遠(yuǎn)收益來(lái)看,心肌梗死的死亡率只是得到了暫時(shí)的控制,而心力衰竭的死亡風(fēng)險(xiǎn)卻在無(wú)形加劇。以干細(xì)胞替代治療為主的實(shí)驗(yàn)研究,近年來(lái)已廣泛開(kāi)展,但仍受細(xì)胞來(lái)源、移植風(fēng)險(xiǎn)等客觀因素的影響,同時(shí)又受倫理道德等因素的約束,在臨床上尚未大規(guī)模應(yīng)用。眾所周知,成熟心肌細(xì)胞增殖能力很低,一旦受到損傷,導(dǎo)致大量心肌細(xì)胞壞死,心臟功能受損甚至衰竭,若能誘導(dǎo)成熟的心肌細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖,心臟再生的難題就有望得到徹底攻克。然而有關(guān)心肌細(xì)胞增殖再生方面尚有諸多問(wèn)題。CyclinA2基因作為細(xì)胞周期的一個(gè)主控因子控制著細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相的及時(shí)轉(zhuǎn)換和循環(huán)往復(fù),對(duì)細(xì)胞周期正確發(fā)揮其調(diào)控作用至關(guān)重要,對(duì)于解決心肌再生問(wèn)題具有很高的研究?jī)r(jià)值。目的探討體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞周期素A2 (Cyclin A2)基因?qū)υ笫笮募〖?xì)胞增殖的影響,為心臟再生提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。方法1.心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)采用酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法,分離、培養(yǎng)、純化大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞,在活細(xì)胞工作站下實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),攝片記錄原代培養(yǎng)過(guò)程中心肌細(xì)胞的形態(tài)變化。2.基因轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)第3天,分別轉(zhuǎn)染帶有預(yù)先包裝好的攜帶目的基因Cyclin A2的重組腺病毒和僅含有綠色熒光蛋白的空病毒。3.實(shí)驗(yàn)分組(1)重組腺病毒CyclinA2基因轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染帶有強(qiáng)化綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)和Cyclin A2基因的重組腺病毒(Ad-CyclinA2-GFP); (2)空病毒轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染不含目的基因僅有GFP的重組腺病毒(Ad-Null-GFP); (3)陰性對(duì)照組：未做轉(zhuǎn)染處理,僅加入等量的培養(yǎng)基。4.GFP示蹤技術(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析評(píng)估原代大鼠心肌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率；對(duì)比實(shí)驗(yàn)組(重組腺病毒Cyclin A2基因轉(zhuǎn)染組)和空病毒載體轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率有無(wú)差異5.間接法免疫熒光雙重標(biāo)記轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)體外培養(yǎng)3-5 d,利用免疫熒光技術(shù)分別檢測(cè)Cyclin A2、磷酸化組蛋白H3 (Phosphorylates Histone H3, H3P)、心肌肌鈣蛋白-T (Cardiac Troponin T, cTnT)的表達(dá)情況。結(jié)果1.原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞8-12 h后多貼壁生長(zhǎng),并可見(jiàn)單個(gè)搏動(dòng)的心肌細(xì)胞,頻率約13-44次/分。3-5 d后細(xì)胞匯集成片狀,形成細(xì)胞簇或單層細(xì)胞,搏動(dòng)趨近同步性,收縮明顯有力,頻率約46-182次/分。2.熒光GFP示蹤表明：重組腺病毒Cyclin A2轉(zhuǎn)染組對(duì)心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率略低于空病毒轉(zhuǎn)染組,空病毒載體侵染原代大鼠心肌細(xì)胞的效率幾乎達(dá)到100%,重組腺病毒Cyclin A2侵染心肌細(xì)胞效率約為(97±0.74)%,活細(xì)胞工作站下可見(jiàn)轉(zhuǎn)染成功的心肌細(xì)胞顯示綠色熒光,并呈現(xiàn)簇狀搏動(dòng)。3.免疫熒光標(biāo)記結(jié)果顯示心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白cTnT分布于細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞核中不存在表達(dá)；大鼠原代心肌細(xì)胞純度高達(dá)(95±0.62)%；心肌細(xì)胞CyclinA2主要在胞核內(nèi)聚集,少數(shù)分布于細(xì)胞質(zhì)；H3P是一種有絲分裂期的特殊標(biāo)記蛋白,以細(xì)胞核內(nèi)分布為主。4.轉(zhuǎn)染Cyclin A2基因后,心肌細(xì)胞有絲分裂指數(shù)明顯增高,約為空病毒轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組的3倍,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); Cyclin A2基因轉(zhuǎn)染組可見(jiàn)大量多核細(xì)胞,以雙核為主,伴少量三核心肌細(xì)胞。結(jié)論1.本研究所采用的酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法,所獲得的原代心肌細(xì)胞不僅純度高,而且細(xì)胞活力好。2.腺病毒對(duì)心肌細(xì)胞有很好的侵染效率,同時(shí)其毒性對(duì)細(xì)胞的影響不明顯,因此可作為心肌細(xì)胞理想的轉(zhuǎn)染載體。3.有絲分裂指數(shù)(H3P陽(yáng)性率)是反映細(xì)胞增殖情況的有力證據(jù),心肌細(xì)胞仍可進(jìn)行有絲分裂,并非終末分化細(xì)胞。4. Cyclin A2基因過(guò)表達(dá)時(shí)可促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖,有絲分裂指數(shù)增加,多數(shù)細(xì)胞形成雙核。
【關(guān)鍵詞】：Cyclin A2 增殖 原代培養(yǎng) 基因轉(zhuǎn)染 心肌細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R54
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-13
• 材料與方法13-23
• 結(jié)果23-30
• 討論30-34
• 小結(jié)34-35
• 參考文獻(xiàn)35-39
• 綜述：CyclinA2基因與心肌再生的關(guān)系及意義39-56
• 參考文獻(xiàn)49-56
• 附錄56-57
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章情況57-58
• 致謝58-59
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷59

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本文編號(hào)：870259