本文關鍵詞：CTRP9對巨噬細胞炎癥因子表達的影響及機制研究

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【摘要】：1研究背景動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)是我國及世界范圍內(nèi)致死、致殘的首要原因,且其發(fā)病率、死亡率仍處于增長趨勢。ASCVD的病理基礎是動脈粥樣硬化(AS),迄今為止,其病理生理機制仍未被完全揭示。眾多證據(jù)表明AS是脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥性血管疾病。斑塊內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應這兩個病理因素互相影響,促進AS進展。其中,巨噬細胞在AS中扮演著重要的角色。荷脂的巨噬細胞產(chǎn)生并釋放大量的炎性細胞因子,參與AS發(fā)生發(fā)展的各個階段。因此,抑制斑塊內(nèi)巨噬細胞炎癥反應對延緩AS的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白9 (CTRP9)是近年發(fā)現(xiàn)的新型脂肪細胞因子,隸屬于C1q腫瘤壞死因子超家族(Clq/TNF-related proteins, CTRPs)。目前研究顯示,CTRP9在調(diào)節(jié)代謝、保護心肌、改善內(nèi)皮功能及抵抗糖尿病心血管損害等方面發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究顯示,CTRP9可增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性并抑制斑塊內(nèi)巨噬細胞炎癥反應。然而,CTRP9抑制巨噬細胞炎癥反應的機制尚不明確。因此,本研究將對CTRP9對巨噬細胞炎癥因子的表達和機制進行深入探討。2研究目的(1)研究CTRP9對巨噬細胞炎癥因子表達的影響；(2)探討CTRP9在巨噬細胞炎癥反應中的作用機制。3材料和方法3.1細胞培養(yǎng)與處理(1)以小鼠RAW264.7巨噬細胞為研究對象。將細胞以DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗配制成的完全培養(yǎng)基于37℃、50%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。(2)實驗采用濃度為100ug/ml的氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激巨噬細胞建立炎癥模型。實驗以CTRP9球狀結構域重組蛋白(gCTRP9)預處理細胞,在完全培養(yǎng)基或oxLDL刺激下,檢測相關因子的表達差異。3.2 Real-time PCR提取各組細胞mRNA。檢測炎癥因子TNF-α、MCP-1的mRNA水平。3.3 Western blot提取各組細胞總蛋白和／或核蛋白。檢測TNF-α、MCP-1、NF-κB、AMPK、 AdipoR1的表達。3.4細胞免疫熒光制作各組細胞爬片。激光共聚焦顯微鏡下觀察TNF-α、MCP-1及AdipoRl的表達以及NF-κB的核轉位情況。3.5 AdipoRl siRNA轉染篩選出抑制效果最優(yōu)的AdipoRl siRNA序列。以Lipo2000轉染巨噬細胞后,用于后續(xù)實驗。3.6統(tǒng)計學分析以SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析,所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示。以單因素方差分析(ANOVA)進行多組間統(tǒng)計分析。P0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。4結果4.1 CTRP9可抑制巨噬細胞炎癥因子的表達Western blot結果顯示,與對照組比較,oxLDL可增加炎癥因子TNF-α和MCP-1的表達(p0.05)；與oxLDL組相比,gCTRP9可濃度依賴性地降低TNF-α和MCP-1的表達(p0.05)。同時,RT-PCR和激光共聚焦成像結果顯示,gCTRP9可顯著抑制oxLDL誘導的TNF-α和MCP-1的mRNA和蛋白的表達(p0.05)。4.2 CTRP9可抑制巨噬細胞NF-κB的活化Western blot結果顯示,與對照組比較,oxLDL可提高NF-κB的磷酸化水平(p0.05)；與oxLDL組相比,gCTRP9可顯著降低NF-κB的磷酸化水平(p0.05)。Western blot及激光共聚焦成像顯示,跟對照組相比,oxLDL可促進NF-κB的核轉位(p0.05),而gCTRP9可抑制oLDL誘導的細胞核NF-κB的表達(p0.05)。4.3 CTRP9在巨噬細胞中的抗炎作用依賴于AMPK磷酸化Western blot結果顯示,gCTRP9可明顯提高AMPK的磷酸化水平(p0.05)；而AMPK的抑制劑Compound C (Com C)顯著抑制gCTRP9引起的AMPK的磷酸化(p0.05)。 Western blot結果顯示,與gCTRP9+oxLDL組比較,Com C取消了gCTRP9對炎癥因子TNF-α和MCP-1的抑制效果(p0.05)；與gCTRP9+oxLDL組比較,Com C取消了gCTRP9對NF-κB的抑制效果(p0.05)。4.4 AdipoR1介導了CTRP9在巨噬細胞中的抗炎作用Western blot結果顯示,與對照組比較,oxLDL不影響AdipoR1的表達；與oxLDL組比較,gCTRP9可增加AdipoR1的表達(p0.05)；同時,激光共聚焦成像結果顯示,與oxLDL組比較,gCTRP9可顯著增加細胞膜表面AdipoR1的表達(p0.05)。Western blot結果顯示,與對照組相比,AdipoR1 siRNA可抑制gCTRP9引起的AMPK磷酸化(p0.05)；與對照組比較,AdipoR1 siRNA取消了gCTRP9對炎癥因子TNF-α和MCP-1的抑制效果(p0.05)。5結論(1) CTRP9可以增加巨噬細胞AdipoR1的表達水平；(2) CTRP9可以通過AdipoR1/AMPK/NF-κB通路抑制巨噬細胞炎癥反應。
【關鍵詞】：C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白9 炎癥 巨噬細胞 腺苷酸活化蛋白激酶 脂聯(lián)素受體1
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R543.5
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-15
• 前言15-18
• 材料與方法18-37
• 實驗結果37-40
• 討論40-43
• 創(chuàng)新點和限制性43-44
• 結論44-45
• 附圖45-50
• 參考文獻50-54
• 致謝54-55
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文55-56
• 學位論文評閱及答辯情況表56

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本文編號：728447