本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子SOX2對體外血管生成能力的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:血管生成,是從已有血管生成新血管的過程,主要步驟包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管狀血管結(jié)構(gòu)的形成。在胚胎發(fā)育過程中,血管生成促進(jìn)胎兒循環(huán)系統(tǒng)的建立。在傷口愈合過程中,血管生成促進(jìn)組織的修復(fù)和再生。病理情況下,如腫瘤,血管生成促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。所以針對血管生成的研究對相關(guān)疾病的治療非常重要。尤其在腫瘤治療中,針對腫瘤血管作為治療靶點(diǎn)的藥物已在臨床廣泛應(yīng)用。SOX(SRY-related HMG box)是一類性別決定基因SRY(sex-determining region of the Y chromosome)相關(guān)基因家族,編碼一系列SOX家族的轉(zhuǎn)錄因子。該蛋白家族擁有高度保守的DNA結(jié)合域,被稱為HMG(high-mobility-group)box域,該結(jié)構(gòu)域包含約80個(gè)氨基酸。SOX2(SRY-related high-mobility-group box 2)為SOX家族轉(zhuǎn)錄因子成員之一,屬于SOX家族的B組。轉(zhuǎn)錄因子SOX2能夠結(jié)合在基因上游特異核苷酸序列上,調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。SOX2發(fā)揮多種作用:SOX2是最初被用于從成纖維細(xì)胞獲得誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一;SOX2對維持胚胎干細(xì)胞的自我更新與多向分化起關(guān)鍵作用;可以調(diào)控神經(jīng)發(fā)育,以及調(diào)控晶狀體和味蕾的發(fā)育等。SOX2在大多數(shù)腫瘤中高表達(dá),且已被廣泛證實(shí)與腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移侵襲等多種生物學(xué)行為存在密切關(guān)系。在正常血管以及內(nèi)皮細(xì)胞來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤中,SOX2存在差異表達(dá)。作為重要的轉(zhuǎn)錄因子,SOX2是否參與調(diào)控血管生成過程?因人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)可代表人體內(nèi)絕大多數(shù)血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝和對外界生理、毒理反應(yīng)的特征,故HUVEC已被許多研究者作為內(nèi)皮細(xì)胞模型。本研究以HUVEC為研究對象。方法:應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法,構(gòu)建高表達(dá)SOX2的HUVEC;應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光法檢測SOX2的表達(dá)及定位;應(yīng)用RT-q PCR檢測SOX2 m RNA水平;Western Blot法檢測蛋白水平,確定高表達(dá)是否成功。應(yīng)用CCK-8、Ed U法檢測HUVEC細(xì)胞增殖能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期;劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移能力;matrigel膠實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞成管能力。結(jié)果:1.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pc DNA3.0-SOX2質(zhì)粒構(gòu)建高表達(dá)SOX2的HUVEC(SOX2+),對照組為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pc DNA3.0質(zhì)粒構(gòu)建的空載體HUVEC(Empty Vector,EV);細(xì)胞免疫熒光方法染色定位SOX2表達(dá)在細(xì)胞核,SOX2+組與EV組細(xì)胞SOX2熒光陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;SOX2+組與EV組SOX2熒光強(qiáng)度分別為82.6%和2.9%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001);利用RT-q PCR、Western Blot分別在m RNA、蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證,與EV組對比,SOX2+組在m RNA、蛋白水平均增高。2.CCK-8檢測,與EV組相比,SOX2+組細(xì)胞增殖能力提高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);Ed U法檢測,EV組的細(xì)胞陽性率小于20%,SOX2+組細(xì)胞陽性率近30%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,相較于EV組增殖指數(shù)53.62%,SOX2+組增殖指數(shù)約55.45%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測HUVEC遷移能力,在12h觀察點(diǎn),SOX2+組細(xì)胞遷移指數(shù)為1.27,顯著高于EV組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);在24h的觀察點(diǎn),SOX2+組細(xì)胞遷移指數(shù)為1.75,顯著高于EV組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001);利用Transwell小室結(jié)晶紫染色觀察到HUVEC遷移進(jìn)入下室,統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)目,SOX2+組遷移細(xì)胞數(shù)目相比EV增多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。4.matrigel膠實(shí)驗(yàn)檢測HUVEC成管能力,SOX2+組小管節(jié)點(diǎn)為25±5,相比EV組18±3增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);SOX2+組小管總長度為341μm,相比EV組284μm增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:轉(zhuǎn)錄因子SOX2可以促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖、遷移及管道形成能力,提示SOX2在體外血管生成中發(fā)揮重要作用。
【關(guān)鍵詞】：血管生成 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 SOX2
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 英文縮略詞表9-12
• 第1章 文獻(xiàn)綜述12-18
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法18-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器18-19
• 2.1.1 主要儀器及耗材18
• 2.1.2 主要試劑18-19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-31
• 2.2.1 HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)19-20
• 2.2.2 質(zhì)粒的擴(kuò)增和提取20-21
• 2.2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染21
• 2.2.4 細(xì)胞免疫熒光21-22
• 2.2.5 RNA提取以及RT-q PCR分析22-24
• 2.2.6 蛋白提取以及Western Blot分析24-26
• 2.2.7 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖26
• 2.2.8 Ed U檢測細(xì)胞增殖26-27
• 2.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期27-28
• 2.2.10 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移28
• 2.2.11 Transwell小室檢測細(xì)胞遷移28-29
• 2.2.12 管道形成實(shí)驗(yàn)29-30
• 2.2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析30-31
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-41
• 3.1 HUVEC中SOX2的表達(dá)31-32
• 3.1.1 形態(tài)學(xué)特征31
• 3.1.2 HUVEC中SOX2的表達(dá)量31-32
• 3.2 制備高表達(dá)SOX2 HUVEC32-34
• 3.2.1 HUVEC中SOX2表達(dá)的定位32-33
• 3.2.2 高表達(dá)SOX2 HUVEC鑒定33-34
• 3.3 高表達(dá)SOX2 HUVEC細(xì)胞增殖、遷移、成管能力鑒定34-41
• 3.3.1 細(xì)胞增殖能力鑒定34-37
• 3.3.2 細(xì)胞遷移能力鑒定37-39
• 3.3.3 細(xì)胞成管能力鑒定39-41
• 第4章 討論41-44
• 第5章 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-50
• 作者簡介及攻讀碩士期間的研究成果50-51
• 致謝51

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