目的：本文主要有三個(gè)目的：1）構(gòu)建胸腺素β4真核表達(dá)載體以用于基因靶向治療；2）構(gòu)建α肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告載體以用于示蹤成體干細(xì)胞向心肌分化；3）探索能靶向缺血心肌血管的靶向子MI1對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行表面修飾的最適濃度。 方法：1）利用pBlast49、pcDNA3.0-Flag、pIRES2-eGFP三種載體構(gòu)建能在真核細(xì)胞表達(dá)胸腺素β4的表達(dá)載體，并將這三種重組子轉(zhuǎn)染到293T、293F、HUVEC三種細(xì)胞中，并通過(guò)Real-time PCR、Western Blot及Elisa三種方法檢測(cè)胸腺素β4的表達(dá)情況；2）利用α肌球蛋白重鏈的啟動(dòng)子特異性驅(qū)動(dòng)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白以構(gòu)建心肌特異性報(bào)告載體。在新生鼠心肌細(xì)胞內(nèi)確定該報(bào)告載體的心肌組織特異性。將該報(bào)告載體經(jīng)電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染入大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)誘導(dǎo)向心肌分化，然后通過(guò)是否表達(dá)綠色熒光蛋白，及使用三型心肌肌鈣蛋白I的免疫熒光確認(rèn)向心肌分化，以確定經(jīng)構(gòu)建載體可用性；3）使用50、250、500、1000、1500μg/mL的能靶向缺血心肌血管的靶向子MI1對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行表面修飾，并對(duì)MI1表面修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的貼...

【文章頁(yè)數(shù)】：123 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1.1 心肌梗死
    1.2 胸腺素β4
    1.3 α肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子
    1.4 干細(xì)胞治療心肌梗死
    1.5 本文研究目的
第二章 胸腺素β4 真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其體外活性鑒定
    2.1 前言
    2.2 材料
        2.2.1 基因載體及細(xì)胞
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 主要儀器設(shè)備
    2.3 方法
        2.3.1 目的基因的擴(kuò)增
        2.3.2 瓊脂糖核酸電泳及 DNA 凝膠回收
        2.3.3 酶切及酶連
        2.3.4 熱敏感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.3.5 熱敏轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆篩選
        2.3.6 質(zhì)粒抽提及序列測(cè)定
        2.3.7 細(xì)胞培養(yǎng)及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
        2.3.8 細(xì)胞免疫熒光
        2.3.9 細(xì)胞總蛋白及總 RNA 抽提
        2.3.10 Realtime PCR 檢測(cè) Tβ4 mRNA 表達(dá)水平
        2.3.11 Elisa 測(cè)定 Tβ4 蛋白含量
        2.3.12 Western Blot 檢測(cè) Tβ4 蛋白
    2.4 結(jié)果
        2.4.1 重組子 Tβ4 基因序列
        2.4.2 重組子轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞
        2.4.3 Tβ4 mRNA 表達(dá)水平
        2.4.4 Western Blot 檢測(cè) Tβ4 蛋白
        2.4.5 Elisa 測(cè)定 Tβ4 蛋白
        2.4.6 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) Tβ4 蛋白
    2.5 討論
第三章 α肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告載體構(gòu)建及其應(yīng)用
    3.1 前言
    3.2 材料
        3.2.1 基因載體、動(dòng)物及細(xì)胞
        3.2.2 主要試劑
        3.2.3 主要儀器設(shè)備
    3.3 方法
        3.3.1 啟動(dòng)子 DNA 片段的擴(kuò)增
        3.3.2 瓊脂糖核酸電泳及 DNA 凝膠回收
        3.3.3 酶切及酶連
        3.3.4 質(zhì)粒抽提及序列測(cè)定
        3.3.5 新生鼠心肌細(xì)胞的分離及培養(yǎng)
        3.3.6 BMSCs 的分離及培養(yǎng)
        3.3.7 報(bào)告載體轉(zhuǎn)染到心肌細(xì)胞和 BMSCs
        3.3.8 BMSCs 向心肌誘導(dǎo)分化
        3.3.9 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)心肌特異性
    3.4 結(jié)果
        3.4.1 報(bào)告載體鑒定的結(jié)果
        3.4.2 新生鼠心肌細(xì)胞及 BMSCs
        3.4.3 轉(zhuǎn)染報(bào)告載體到心肌細(xì)胞及 BMSCs
        3.4.4 BMSCs 向心肌誘導(dǎo)分化
        3.4.5 細(xì)胞免疫熒光鑒定心肌特異性
    3.5 討論
第四章 靶肽 MI1 表面修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
    4.1 前言
    4.2 材料
        4.2.1 動(dòng)物
        4.2.2 主要試劑
        3.2.3 主要儀器設(shè)備
    4.3 方法
        4.3.1 BMSCs 的分離及培養(yǎng)
        4.3.2 BMSCs 的表面修飾
        4.3.3 MI1 對(duì) BMSCs 生長(zhǎng)的影響
        4.3.4 初步探究 MI1-BMSCs 在梗死心肌區(qū)域的分布
    4.4 結(jié)果
        4.4.1 BMSCs
        4.4.2 BMSCs 的表面修飾
        4.4.3 MI1 對(duì) BMSCs 貼壁的影響
        4.4.4 MI1 對(duì) BMSCs 傳代的影響
        4.4.5 MI1-BMSCs 在梗死心臟中的分布
    4.5 討論
第五章 全文結(jié)果匯總
第六章 結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
附錄
在學(xué)期間發(fā)表的論文及科研成果清單
特別鳴謝
致謝



本文編號(hào)：3873667