血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是體內(nèi)重要的血管生長因子，促進內(nèi)皮細胞分裂增殖和新血管的生成。VEGF165是VEGF家族中活性最強的因子，在內(nèi)皮細胞相關(guān)的基礎(chǔ)研究、信號途徑、臨床診斷等方面具有重要作用，因此如何對其進行準(zhǔn)確快速的檢測已經(jīng)成為研究的重點。常用檢測蛋白方法是以抗體為工具，因其本身的缺陷，限制了其應(yīng)用。核酸適體為一段寡聚單鏈DNA或RNA分子，與抗體相比具有較高的特異性和親和性，同時具有穩(wěn)定性好、制備周期短、免疫原性小、靶分子范圍廣等優(yōu)點，作為可替代抗體的適體，在科學(xué)研究、臨床診斷和治療中具有很好的前景。 本文首先探討了以適體替代抗體通過點雜交和Eastern blotting方法體外檢測非還原狀態(tài)和還原狀態(tài)的VEGF165。并和以抗體做的結(jié)果進行比較。另外，本文還利用基于適體的局部保護原理（Aptamer-Based Regionally Protected PCR,ARP-PCR），對VEGF165蛋白進行檢測。適體與蛋白孵育結(jié)合后，加入DNase I將未與蛋白結(jié)合的適體酶切掉，由于蛋白的保護作用... 

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 VEGF_(165)的研究進展
        1.1.1 VEGF_(165)的結(jié)構(gòu)及特性
        1.1.2 VEGF_(165)的信號通路
        1.1.3 VEGF_(165)的生物學(xué)功能
        1.1.4 VEGF_(165)的促血管生成機制
        1.1.5 VEGF_(165)與腫瘤的關(guān)系
        1.1.6 以 VEGF 和 VEGFR 為靶點抗腫瘤血管治療
    1.2 適體的研究進展
        1.2.1 核酸適體的優(yōu)勢
        1.2.2 SELEX 技術(shù)基本流程與分類
        1.2.3 適體檢測方面的應(yīng)用
    1.3 課題選題依據(jù)
第2章 點雜交和 Eastern blotting 法檢測蛋白
    2.1 實驗材料、試劑及儀器
        2.1.1 主要實驗試劑
        2.1.2 主要實驗儀器
        2.1.3 主要試劑的配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 點雜交驗證生物素和鏈霉親和素的結(jié)合
        2.2.2 點雜交以抗體檢測非還原 VEGF_(165)蛋白
        2.2.3 點雜交以適體檢測非還原 VEGF_(165)蛋白
        2.2.4 Western blotting 以抗體檢測還原 VEGF_(165)蛋白
        2.2.5 Eastern blotting 以適體檢測還原 VEGF_(165)蛋白
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 點雜交驗證生物素和鏈霉親和素的結(jié)合
        2.3.2 點雜交以抗體檢測非還原 VEGF_(165)蛋白
        2.3.3 點雜交以適體檢測非還原 VEGF_(165)蛋白
        2.3.4 Western blotting 以抗體檢測還原 VEGF_(165)蛋白
        2.3.5 Eastern blotting 以適體檢測還原 VEGF_(165)蛋白
    2.4 小結(jié)
第3章 優(yōu)化酶切保護檢測蛋白的方法
    3.1 實驗材料、試劑及儀器
        3.1.1 主要實驗試劑
        3.1.2 主要實驗儀器
        3.1.3 主要試劑的配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 優(yōu)化 50bp marker 的電泳條件
        3.2.2 Real-time PCR 優(yōu)化適體擴增循環(huán)次數(shù)
        3.2.3 優(yōu)化酶切產(chǎn)物擴增的 PCR 體系
        3.2.4 優(yōu)化酶切過程中 DNase I 的用量
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 優(yōu)化 50bp marker 的電泳條件
        3.3.2 Real-time PCR 檢測適體擴增過程
        3.3.3 優(yōu)化酶切產(chǎn)物擴增的 PCR 體系
        3.3.4 優(yōu)化酶切過程中 DNase I 的用量
    3.4 小結(jié)
第4章 ARP-PCR 法的可行性驗證
    4.1 實驗材料、試劑及儀器
        4.1.1 主要實驗試劑
        4.1.2 主要實驗儀器
        4.1.3 主要試劑的配制
    4.2 實驗方法
        4.2.1 普通 PCR 驗證引物可行性
        4.2.2 未加蛋白下 DNase I 的酶切情況
        4.2.3 加蛋白下 DNase I 的酶切情況
        4.2.4 ARP-PCR 法特異性檢測
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 普通 PCR 驗證引物可行性
        4.3.2 未加蛋白下 DNase I 的酶切情況
        4.3.3 加蛋白下 DNase I 的酶切情況
        4.3.4 ARP-PCR 法特異性檢測
    4.4 小結(jié)
第5章 利用 Exo I 的酶切檢測
    5.1 實驗材料、試劑及儀器
        5.1.1 主要實驗試劑
        5.1.2 主要實驗儀器
        5.1.3 主要試劑的配制
    5.2 實驗方法
        5.2.1 未加蛋白下 Exo I 的酶切情況
        5.2.2 變構(gòu)作用和緩沖液對酶切的影響
        5.2.3 Exo I 的用量對酶切的影響
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 未加蛋白下 Exo I 的酶切情況
        5.3.2 變構(gòu)作用和緩沖液對酶切的影響
        5.3.3 Exo I 的用量對酶切的影響
    5.4 小結(jié)
第6章 總結(jié)
參考文獻
致謝
個人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果



本文編號：3735901