發(fā)布時(shí)間：2017-04-20 05:16

  本文關(guān)鍵詞：白藜蘆醇通過(guò)mTOR信號(hào)通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞株H9C2心肌細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)為模型,模擬心肌缺血再灌注后的炎癥反應(yīng),從細(xì)胞、分子和蛋白層面探討白藜蘆醇對(duì)心肌缺血再灌注損傷中炎癥反應(yīng)的抑制作用及其信號(hào)機(jī)制。 [方法]體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞株H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分成空白對(duì)照組、LPS(1μg/ml,20min-24h)處理組、不同濃度的白藜蘆醇(0.05、1和10μM,1h)+LPS處理組、不同濃度的白藜蘆醇+LPS+Rapamycin (1μM)共同處理組。采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)檢測(cè)白藜蘆醇、LPS以及Rapamycin對(duì)H9C2心肌細(xì)胞的活力影響；采用免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè)方法(double-immunofluorescence labeling assay)在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor, TNF-α)和白介素-6(interleukin-1β, IL-6)蛋白水平的變化；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測(cè)iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6的mRNA水平的變化；采用免疫組化及凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)方法分別觀察NF-κB的核轉(zhuǎn)位情況；采用蛋白質(zhì)印跡分析方法(western blotting)檢測(cè)促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)家族的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2, ERK1/2)、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK)和p38促分裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinases, p38MAPK)以及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)等細(xì)胞信號(hào)通路蛋白和核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB, IκB)的表達(dá)及其變化規(guī)律。 [結(jié)果]H9C2心肌細(xì)胞以1×104cells/ml濃度接種于6孔板中,當(dāng)密度均勻生長(zhǎng)至80%時(shí),使用MTT檢測(cè)H9C2心肌細(xì)胞活力影響,結(jié)果顯示：經(jīng)白藜蘆醇(0.05、1和10μM)、LPS (1μg/ml)和Rapamycin (1μM)分別處理或共同處理24h后該細(xì)胞活性均無(wú)明顯影響；加入mTOR抑制劑Rapamycin(1μM)1h后,再加入白藜蘆醇和LPS處理細(xì)胞20min-3h,免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè)方法、RT-PCR、EMSA、免疫組化以及western blotting分析,得到結(jié)果：1)不同濃度的白藜蘆醇在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平通過(guò)mTOR信號(hào)通路明顯抑制LPS誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞促炎性蛋白酶iNOS和COX-2的表達(dá)；2)不同濃度的白藜蘆醇在mRNA水平和蛋白水平通過(guò)mTOR信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)：3)白藜蘆醇可以抑制LPS誘導(dǎo)的IκB磷酸化及NF-κB核轉(zhuǎn)位：4)白藜蘆醇能顯著增強(qiáng)mTOR信號(hào)通路的激活,并能拮抗LPS誘導(dǎo)引起的mTOR信號(hào)通路的失活；5)白藜蘆醇通過(guò)mTOR信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化。 [結(jié)論]1)0.05-10μM的白藜蘆醇、1μg/ml的LPS和1μM的Rapamycin對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有影響；2)白藜蘆醇通過(guò)mTOR信號(hào)通路抑制MAPKs的磷酸化及NF-κB核轉(zhuǎn)位來(lái)調(diào)控LPS誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)促炎性蛋白酶以及促炎性細(xì)胞因子的釋放：3)白藜蘆醇能激活mTOR信號(hào)通路發(fā)揮其抗炎作用。
【關(guān)鍵詞】：白藜蘆醇 脂多糖 炎性因子 mTOR信號(hào)通路 MAPKs信號(hào)通路 NF-κB信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R541.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 英文縮略詞表9-10
• 前言10-12
• 材料與方法12-32
• 1. 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及其配制12-18
• 2. 細(xì)胞培養(yǎng)18-19
• 3. 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組19-20
• 4. 細(xì)胞活性測(cè)定20
• 5. 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)mRNA水平的檢測(cè)20-23
• 6. 免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè)23-24
• 7. 凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)24-27
• 8. 免疫細(xì)胞化學(xué)27
• 9. 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)27-31
• 10. 統(tǒng)計(jì)分析31-32
• 結(jié)果32-46
• 討論46-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 文獻(xiàn)綜述158-64
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 文獻(xiàn)綜述264-72
• 參考文獻(xiàn)69-72
• 在讀期間發(fā)表的文章72-73
• 致謝73-74

【共引文獻(xiàn)】

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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  本文關(guān)鍵詞：白藜蘆醇通過(guò)mTOR信號(hào)通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：317988