本文關(guān)鍵詞：白藜蘆醇通過mTOR信號通路抑制脂多糖誘導的心肌細胞炎癥反應的實驗研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的大鼠心肌細胞株H9C2心肌細胞產(chǎn)生炎癥反應為模型,模擬心肌缺血再灌注后的炎癥反應,從細胞、分子和蛋白層面探討白藜蘆醇對心肌缺血再灌注損傷中炎癥反應的抑制作用及其信號機制。 [方法]體外培養(yǎng)的大鼠心肌細胞株H9C2心肌細胞隨機分成空白對照組、LPS(1μg/ml,20min-24h)處理組、不同濃度的白藜蘆醇(0.05、1和10μM,1h)+LPS處理組、不同濃度的白藜蘆醇+LPS+Rapamycin (1μM)共同處理組。采用四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)檢測白藜蘆醇、LPS以及Rapamycin對H9C2心肌細胞的活力影響；采用免疫熒光雙標記檢測方法(double-immunofluorescence labeling assay)在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor, TNF-α)和白介素-6(interleukin-1β, IL-6)蛋白水平的變化；應用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6的mRNA水平的變化；采用免疫組化及凝膠遷移率實驗(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)方法分別觀察NF-κB的核轉(zhuǎn)位情況；采用蛋白質(zhì)印跡分析方法(western blotting)檢測促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)家族的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2, ERK1/2)、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK)和p38促分裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinases, p38MAPK)以及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)等細胞信號通路蛋白和核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB, IκB)的表達及其變化規(guī)律。 [結(jié)果]H9C2心肌細胞以1×104cells/ml濃度接種于6孔板中,當密度均勻生長至80%時,使用MTT檢測H9C2心肌細胞活力影響,結(jié)果顯示：經(jīng)白藜蘆醇(0.05、1和10μM)、LPS (1μg/ml)和Rapamycin (1μM)分別處理或共同處理24h后該細胞活性均無明顯影響；加入mTOR抑制劑Rapamycin(1μM)1h后,再加入白藜蘆醇和LPS處理細胞20min-3h,免疫熒光雙標記檢測方法、RT-PCR、EMSA、免疫組化以及western blotting分析,得到結(jié)果：1)不同濃度的白藜蘆醇在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平通過mTOR信號通路明顯抑制LPS誘導的H9C2心肌細胞促炎性蛋白酶iNOS和COX-2的表達；2)不同濃度的白藜蘆醇在mRNA水平和蛋白水平通過mTOR信號通路抑制LPS誘導的H9C2心肌細胞促炎性細胞因子TNF-α和IL-6的表達：3)白藜蘆醇可以抑制LPS誘導的IκB磷酸化及NF-κB核轉(zhuǎn)位：4)白藜蘆醇能顯著增強mTOR信號通路的激活,并能拮抗LPS誘導引起的mTOR信號通路的失活；5)白藜蘆醇通過mTOR信號通路抑制LPS誘導的H9C2心肌細胞ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化。 [結(jié)論]1)0.05-10μM的白藜蘆醇、1μg/ml的LPS和1μM的Rapamycin對細胞活性沒有影響；2)白藜蘆醇通過mTOR信號通路抑制MAPKs的磷酸化及NF-κB核轉(zhuǎn)位來調(diào)控LPS誘導的H9C2心肌細胞內(nèi)促炎性蛋白酶以及促炎性細胞因子的釋放：3)白藜蘆醇能激活mTOR信號通路發(fā)揮其抗炎作用。
【關(guān)鍵詞】：白藜蘆醇 脂多糖 炎性因子 mTOR信號通路 MAPKs信號通路 NF-κB信號通路
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R541.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 英文縮略詞表9-10
• 前言10-12
• 材料與方法12-32
• 1. 實驗儀器、試劑及其配制12-18
• 2. 細胞培養(yǎng)18-19
• 3. 實驗細胞分組19-20
• 4. 細胞活性測定20
• 5. 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應mRNA水平的檢測20-23
• 6. 免疫熒光雙標記檢測23-24
• 7. 凝膠遷移率實驗24-27
• 8. 免疫細胞化學27
• 9. 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測27-31
• 10. 統(tǒng)計分析31-32
• 結(jié)果32-46
• 討論46-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻52-58
• 文獻綜述158-64
• 參考文獻61-64
• 文獻綜述264-72
• 參考文獻69-72
• 在讀期間發(fā)表的文章72-73
• 致謝73-74

【共引文獻】

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本文編號：317988