本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-214抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞膠原分泌，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：心肌梗死是冠狀動(dòng)脈持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，嚴(yán)重危害人類的健康。心肌梗死后發(fā)生心室重構(gòu)、導(dǎo)致心肌肥大，心肌纖維化，最終形成心力衰竭。多年來(lái)雖有許多治療方法，包括介入、藥物治療、外科手術(shù)等等，還包括嘗試干細(xì)胞移植在內(nèi)的先進(jìn)技術(shù)，但無(wú)法中斷心衰的進(jìn)展，因此尋求更有效更先進(jìn)的治療方法已成為一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。近幾年，基因治療越來(lái)越被人們廣泛接受，大量文獻(xiàn)顯示microRNAs(miRNAs)參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和代謝過(guò)程。最近miRNAs與心血管疾病的研究逐漸增多，其中microRNA-214(miR-214)是新發(fā)現(xiàn)的因子。近期有研究報(bào)道m(xù)iR-214對(duì)心肌有保護(hù)作用，但對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚。當(dāng)心肌收縮力減弱時(shí)，心臟排血量降低，腎血流量隨之減低，從而腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(rein-angiotensin-aldosterone system，RAAS)被激活。RAAS被激活后，血管緊張素（Angiotensin，AngII）分泌增加，刺激成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白，，使膠原纖維合成增多，促使心肌間質(zhì)纖維化，發(fā)生心室重構(gòu)。因此本研究采用AngII刺激心肌成纖維細(xì)胞（cardiacfibroblasts，CFS），建立心肌成纖維細(xì)胞纖維化模型，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-214來(lái)觀察miR-214對(duì)AngII刺激CFS纖維化的作用，意圖尋找出延緩心室重構(gòu)，抑制心肌纖維化的有效方法。 方法： 1心肌成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 取出生1-3天的SD乳大鼠，低溫麻醉，取出心室肌組織剪成小塊，用胰酶消化法通過(guò)差時(shí)貼壁分離培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞，用波形蛋白（Vimentin）來(lái)鑒定其純度。 2不同濃度不同時(shí)間AngII對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的作用 取原代心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時(shí)，饑餓24小時(shí)后，用AngII刺激CFS。實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組(normal control)，AngII作用組(AngIIgroup，濃度分別為10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，作用時(shí)間為24小時(shí)），通過(guò)MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力；再取適當(dāng)濃度，作用不同時(shí)間（6h、12h、24h），同樣用MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力。 3不同濃度AngII誘導(dǎo)后CFS分泌膠原的變化 取原代心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時(shí)，饑餓24小時(shí)后，用AngII刺激CFS。實(shí)驗(yàn)分組（同方法2）：正常對(duì)照組(normal control)，AngII作用組(AngIIgroup，濃度分別為10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，作用時(shí)間為24小時(shí)），通過(guò)羥脯氨酸測(cè)試盒檢測(cè)各組細(xì)胞分泌的膠原含量；再取AngII10-6mo1/L濃度，作用不同時(shí)間（6h、12h、24h），同樣用羥脯氨酸測(cè)試盒檢測(cè)各組細(xì)胞分泌的膠原含量。 4Q-PCR法檢測(cè)不同濃度AngII作用下的心肌成纖維細(xì)胞中miR-214的表達(dá) 取原代心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時(shí)，饑餓24小時(shí)后，用AngII刺激CFS。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組(normal control)，AngII作用組(AngIIgroup，濃度分別為10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，作用時(shí)間為24小時(shí)），通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR法（real time PCR）測(cè)定不同濃度AngII作用后成纖維細(xì)胞中miR-214的表達(dá)水平。 5Q-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-214后，心肌成纖維細(xì)胞中miR-214的表達(dá) 取原代心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為五組（正常對(duì)照組、前體組、前體空白對(duì)照組、抑制劑組、抑制劑空白對(duì)照組，作用時(shí)間為24小時(shí)），通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR法（real time PCR）測(cè)定各組中miR-214的表達(dá)水平。 6Q-PCR法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-214后，再經(jīng)AngII誘導(dǎo)下的心肌成纖維細(xì)胞中COLI、COLIII、TGFβ1、MMP-1、MMP-2、TIMPI-1的mRNA表達(dá) 取原代心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，進(jìn)行饑餓處理再給予10-6mol/L AngII刺激，然后提取總RNA。實(shí)驗(yàn)分為六組（正常對(duì)照組、AngII組、AngII+前體組、AngII+前體空白對(duì)照組、AngII+抑制劑組、AngII+抑制劑空白對(duì)照組），通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR法（realtime PCR）測(cè)定各組中COLI、COLIII、TGFβ1、MMP-1、MMP-2、TIMPI-1的mRNA表達(dá)水平。 7Western法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-214后，再經(jīng)AngII誘導(dǎo)下的心肌成纖維細(xì)胞中COLI、COLIII、MMP-1、MMP-2和TGFβ1蛋白表達(dá) 取原代心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，進(jìn)行饑餓處理再給予10-6mol/L AngII刺激，然后提取總蛋白。實(shí)驗(yàn)分為六組（正常對(duì)照組、AngII組、AngII+前體組、AngII+前體空白對(duì)照組、AngII+抑制劑組、AngII+抑制劑空白對(duì)照組），通過(guò)Western法檢測(cè)定各組中COLI、COLIII、MMP-1、MMP-2、TGFβ1、的蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 心肌成纖維細(xì)胞總體呈‘S’型趨勢(shì)生長(zhǎng)，2~4天處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第4天之后進(jìn)入平臺(tái)期。光鏡下呈三角形，梭行或多邊形；免疫組化結(jié)果顯示vimentin陽(yáng)性部位可見(jiàn)棕黃色細(xì)絲狀或點(diǎn)狀細(xì)密顆粒（Vimentin）存在于細(xì)胞胞漿中，分布較均勻，純度達(dá)95%。 2AngII對(duì)心肌成纖維細(xì)胞活力的影響 MTT檢測(cè)結(jié)果提示，心肌成纖維細(xì)胞增殖能力隨著AngII濃度的升高，作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性。我們選取引起細(xì)胞增殖約50%左右的AngII濃度（10-6mol/L）作用24h，建立心肌成纖維細(xì)胞纖維化模型。 3AngII對(duì)CFS分泌膠原的影響 羥脯氨酸測(cè)試盒檢測(cè)結(jié)果提示，經(jīng)AngII干預(yù)后，與正常對(duì)照組相比，AngII（10-8、10-7、10-6、10-5mol/L）組的羥脯氨酸含量隨AngII濃度的升高作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明心肌成纖維細(xì)胞分泌的膠原蛋白隨AngII濃度的升高作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增多。 4不同濃度AngII作用對(duì)心肌成纖維細(xì)胞中miR-214表達(dá)的影響 q-PCR檢測(cè)顯示，與正常對(duì)照組相比，AngII組miR-214的表達(dá)水平顯著下降，且隨AngII濃度的升高逐漸下降。 5經(jīng)miR-214轉(zhuǎn)染后心肌成纖維細(xì)胞miR-214的表達(dá) q-PCR檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)入前體組的miR-214表達(dá)水平明顯高于前體空白對(duì)照組，而轉(zhuǎn)入抑制劑組的miR-214表達(dá)水平明顯低于抑制劑空白對(duì)照組，正常對(duì)照組與前體空白對(duì)照組、抑制劑空白對(duì)照組相比無(wú)差異，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。 6miR-214對(duì)AngII干預(yù)下的心肌成纖維細(xì)胞中COLI、COLIII、TGFβ1、MMP-1、MMP-2、TIMPI-1的mRNA表達(dá)的影響 q-PCR檢測(cè)顯示:AngII組中CFS的COLI、COLIII、TGFβ1、TIMPI-1mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（P0.01）；AngII+前體組CFS中COLI、COLIII、TGFβ1、TIMPI-1mRNA表達(dá)水平明顯低于AngII組（P0.01），而與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。在AngII+抑制劑組COLI、COLIII、TGFβ1、TIMPI-1mRNA表達(dá)水平顯著高于AngII組（P0.05）。AngII+前體空白對(duì)照組、AngII+抑制劑空白對(duì)照組COLI、COLIII、TGFβ1、TIMPI-1mRNA表達(dá)水平與AngII組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。AngII組中CFS的MMP-1、MMP-2mRNA表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組（P0.05）；AngII+前體組中MMP-1、MMP-2mRNA表達(dá)水平明顯高于AngII組（P0.01），而與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。在AngII+抑制劑組MMP-1、MMP-2mRNA表達(dá)水平顯著低于AngII組（P0.01）。AngII+前體空白對(duì)照組、AngII+抑制劑空白對(duì)照組MMP-1、MMP-2mRNA表達(dá)水平與AngII組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 7miR-214對(duì)AngII干預(yù)下的心肌成纖維細(xì)胞中COLI、COLIII、MMP-1、MMP-2和TGFβ1蛋白表達(dá)的影響 Western-blot法檢測(cè)顯示:AngII組中CFS的COLI、COLIII、TGFβ1蛋白表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞組（P0.05）；AngII+前體組CFS中COLI、COLIII、TGFβ1蛋白表達(dá)水平明顯低于AngII組（P0.05），而COLI、COLIII蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05），TGFβ1蛋白表達(dá)水平稍高于AngII組（P0.05）。在AngII+抑制劑組COLI、COLIII、TGFβ1蛋白表達(dá)水平顯著高于AngII組（P0.05）。AngII+前體空白對(duì)照組、AngII+抑制劑空白對(duì)照組COLI、COLIII、TGFβ1蛋白表達(dá)水平與AngII組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。AngII組中CFS的MMP-1、MMP-2蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組（P0.01）；AngII+前體組中MMP-1、MMP-2蛋白表達(dá)水平明顯高于AngII組（P0.05），而與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。在AngII+抑制劑組MMP-1、MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著低于AngII組（P0.05）。AngII+前體空白對(duì)照組、AngII+抑制劑空白對(duì)照組MMP-1蛋白表達(dá)水平稍低于AngII組（P0.05）。AngII+前體空白對(duì)照組、AngII+抑制劑空白對(duì)照組MMP-2蛋白表達(dá)水平與AngII組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 結(jié)論： 1AngII刺激心肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白，并且呈濃度和時(shí)間依賴性。AngII(10-6mol/L)作用心肌成纖維細(xì)胞24h可使活力提升50%左右。 2在心肌成纖維細(xì)胞中，miR-214的表達(dá)隨AngII濃度的升高而成下降趨勢(shì)，miR-214過(guò)表達(dá)可以抑制膠原蛋白I、III的分泌，說(shuō)明miR-214與纖維化有關(guān)。 3miR-214可通過(guò)抑制促纖維化因子TGF-β1表達(dá)，抑制TIMP1的合成，從而促進(jìn)MMP-1和MMP-2表達(dá)，抑制膠原蛋白的產(chǎn)生，達(dá)到抑制纖維化的目的。
【關(guān)鍵詞】：MicroRNA-214 血管緊張素II 心肌成纖維細(xì)胞 纖維化 TGFβ1 MMPs
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R542.22
【目錄】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-15
• 前言15
• 材料與方法15-31
• 結(jié)果31-36
• 附圖36-47
• 附表47-52
• 討論52-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 綜述 MicroRNA 與心肌纖維化61-70
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 致謝70-71
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷71

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 張冬梅;秦英;呂浠瀅;吳愛(ài)明;朱陵群;王碩仁;姜良鐸;;川芎嗪對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖及Ⅰ型膠原合成的影響[J];中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào);2009年03期

2 張苗苗;于海奕;祖凌云;徐明;王貴松;高煒;;miR-214在大鼠心肌缺血再灌注損傷及缺血后適應(yīng)中的表達(dá)及機(jī)制探討[J];中國(guó)分子心臟病學(xué)雜志;2011年02期

  本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-214抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞膠原分泌，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：258834