本文關(guān)鍵詞： 鐵調(diào)素 動脈粥樣硬化 內(nèi)皮功能 川芎嗪 膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1　出處：《中國中醫(yī)科學院》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景：動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是由多種因素導致的慢性血管性疾病,是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ),內(nèi)皮細胞功能障礙是AS的始動環(huán)節(jié),保護血管內(nèi)皮對于AS的早期防治意義重大。關(guān)于AS的發(fā)病機制存在不同方面的學說,主要包括脂質(zhì)浸潤學說、炎癥反應學說、損傷反應學說、血栓源學說及天然免疫假說等。脂質(zhì)浸潤學說認為AS的產(chǎn)生主要由脂質(zhì)代謝失常引起,由高血脂所致的內(nèi)皮功能障礙、炎癥反應、氧化應激等亦被認為是動脈粥樣硬化斑塊形成的病理基礎(chǔ)。隨著鐵代謝與AS的相關(guān)性研究逐漸增多,鐵在AS進展中的促進作用已得到證實,在AS的初期出現(xiàn)斑塊內(nèi)鐵沉積增多,通過限鐵飲食或鐵螯合劑治療則可減少鐵沉積、延緩AS及增強斑塊穩(wěn)定性,對心腦血管疾病起到保護作用。近年來,因一種調(diào)控機體鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵物質(zhì)一鐵調(diào)素(hepcidin)的發(fā)現(xiàn),研究者們對機體鐵代謝的分子機制有了更深入的認識,hepcidin異常表達所致鐵過負荷對心血管疾病的影響逐漸成為研究熱點。Hepcidin是鐵的自我平衡調(diào)節(jié)器,而機體的鐵穩(wěn)態(tài)主要受hepcidin與膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1(ferroportin, FPN1)調(diào)控,FPN1是hepcidin的受體以及調(diào)控點,它是細胞鐵輸出的效應器,在細胞鐵釋放中發(fā)揮重要作用,hepcidin通過與細胞表面的FPN1結(jié)合,誘導其內(nèi)化降解來調(diào)控細胞內(nèi)的鐵,hepcidin表達的異常可導致機體鐵代謝紊亂�，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)hepcidin在AS斑塊中高表達,可使巨噬細胞內(nèi)的鐵沉積增多,促進斑塊的不穩(wěn)定性,說明hepcidin與AS斑塊內(nèi)的鐵沉積及斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)。已有研究證實鐵過負荷可引起小鼠的血脂代謝紊亂,可見鐵代謝異常與高脂血癥之間具有密切的聯(lián)系,但是二者之間究竟是如何相互影響?高血脂可否通過誘導hepcidin異常表達影響鐵代謝參與血管內(nèi)皮損傷,進而影響AS進程?這個過程與高脂血癥伴隨炎癥反應是否有關(guān)?而通過干預hepcidin-ferroportin是否影響AS發(fā)生發(fā)展過程,目前尚無研究報道。Maura Poli等發(fā)現(xiàn),肝素可通過抑制BMP/SMAD及JAK/STAT兩條通路來抑制hepcidin的表達,進而影響機體的鐵代謝。肝素是一種粘多糖硫酸酯類抗凝血藥,除抗凝作用外,還可通過抑制平滑肌細胞遷移和增殖、調(diào)節(jié)血脂代謝、保護血管內(nèi)皮等作用以抑制AS的發(fā)生發(fā)展,但肝素在臨床常用注射給藥的方法,且易引起自發(fā)性出血等不良反應,在一定程度上限制了其臨床使用。而活血化瘀中藥現(xiàn)廣泛用于抗AS治療并顯示出良好療效,比如丹參、赤芍、川芎等,可通過抗炎、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等方面抑制AS的進展。其中,川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是中藥川芎的根莖中提取的有效成分,既往研究顯示其可通過具有抑制血小板聚集、平滑肌細胞增殖,抗脂質(zhì)過氧化和保護血管內(nèi)皮細胞功能等方面發(fā)揮抗AS作用,臨床上廣泛用于心腦血管疾病的治療。鐵過載所致的色素沉著及黑斑與中醫(yī)血瘀證極其類似,那么作為具有代表性的活血化瘀中藥-川芎嗪的抗AS效應是否與其抑制鐵過載有關(guān)?又是否通過影響hepcidin表達而發(fā)揮作用?為此我們開展了本項研究。本研究通過構(gòu)建高脂血癥大鼠模型,觀察高血脂狀態(tài)對大鼠血清hepcidin表達的影響,以及抑制hepcidin表達后血管內(nèi)皮損傷程度的變化情況；為明確hepcidin異常表達與內(nèi)皮損傷的相關(guān)性,借助hepcidin調(diào)控子FPN1基因內(nèi)皮敲除(FPN1Tek-cre)小鼠模型,與同品系小鼠C57BL／6對照觀察FPN1 Tek-cre小鼠的內(nèi)皮損傷程度及功能變化；并在高血脂狀態(tài)下進一步觀察hepcidin上游通路p-Stat3蛋白與p-Smad 1/5/8蛋白表達量的變化；并觀察川芎嗪干預后上述模型的內(nèi)皮損傷、鐵代謝及hepcidin相關(guān)通路等指標的變化,以期以明確hepcidin參與AS的機制及川芎嗪的干預效應,為AS的發(fā)病機理研究及活血化瘀中藥抗AS的作用機制研究提供新的思路及科學依據(jù)。本課題研究包括以下兩部分：文獻綜述和實驗研究。1文獻綜述：本部分從“動脈粥樣硬化與血管內(nèi)皮損傷機制研究進展”、“鐵代謝與斑塊穩(wěn)定性的相關(guān)研究進展”和"Hepcidin的生物學效應”三個方面進行綜述。2實驗研究：包括以下三個部分。研究一高脂血癥大鼠hepcidin表達變化對內(nèi)皮功能的影響目的：探討高脂血癥大鼠hepcidin表達變化對內(nèi)皮功能的影響。方法：24只SD大鼠隨機分為4組：空白對照組(N)、高脂模型組(M)、肝素組(MH)及川芎嗪組(MT),每組6只。除空白對照組以普通飼料喂養(yǎng)外,其余3組均以高脂飼料喂養(yǎng)。8周后,N組及M組給予生理鹽水2 ml/(kg-d), MH組和MT組分別給予肝素鈉5mg/(kg-d)、鹽酸川芎嗪注射液40mg/(kg-d)腹腔注射,連續(xù)7天。注射7天后,所有大鼠禁食不禁水8h,腹主動脈取血后分離血清,生化法檢測各組血脂,ELISA法檢測血清鐵調(diào)素(Hepcidin) 、白細胞介素1(IL-1)、白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子-a (TNF-a)、一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素1(ET-1)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)的表達。結(jié)果：與N組相比,M組、MH組及MT組的血脂水平均顯著升高(P0.05)；M組血清hepcidi、 IL-1、 IL-6、 TNF-a、ET-1、 ROS、MDA含量均有不同程度升高(P0.05),NO與SOD及CAT降低(P0.05)。與M組相比,MH組和MT組血清hepcidin、 IL-1、IL-6、 TNF-a、ET-1、 ROS、 MDA含量均有降低(P0.05,P0.01),但MH組下降更為明顯,而給藥兩組NO及CAT升高(P0.05),其中SOD有升高趨勢,但組間比較無統(tǒng)計學差異。小結(jié)：隨著血脂水平升高,hepcidin呈高表達趨勢,伴隨著大鼠血管內(nèi)皮損傷程度加重,同時炎癥因子表達增加,抗氧化能力下降,內(nèi)皮功能紊亂。在應用肝素干預后,血脂水平雖沒有下降,但是hepcidin表達水平下降,大鼠血管內(nèi)皮損傷程度減輕,炎癥因子表達降低,抗氧化能力有所改善,川芎嗪與肝素有類似作用,故推測川芎嗪對內(nèi)皮的保護機制可能與其對hepcidin高表達的抑制作用有關(guān)。研究二高血脂狀態(tài)下FPN1基因敲除后小鼠內(nèi)皮功能的變化目的：通過構(gòu)建高脂血癥模型觀察FPN1基因內(nèi)皮敲除對小鼠內(nèi)皮功能、氧化應激反應、炎癥反應的影響以及川芎嗪的干預效應。方法：80只FPN1 Tek-cre小鼠與40只C57BL/6小鼠均為雌雄各半,分別隨機分組,每組20只,共6組,1組C57BL/6小鼠與2組FPN1 Tek-cre小鼠以普通飼料喂養(yǎng)4周,剩余3組以高脂飼料喂養(yǎng)4周,建立高脂血癥模型。喂養(yǎng)4周后,將以普通飼料喂養(yǎng)的小鼠中,C57BL/6小鼠設(shè)為空白對照組(N),FPN1Tek-cre小鼠隨機分為FPN1 Tek-cre小鼠普食組(FN)及FPN1 Tek-cre小鼠普食川芎嗪組(FNT)；以高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠中, C57BL/6小鼠設(shè)為高脂模型組(M),FPN1 Tek-cre小鼠隨機分為FPN1 Tek-cre小鼠高脂組(FM)及FPN1 Tek-cre小鼠高脂川芎嗪組(FMT)。N, M, FN及FM組給予生理鹽水2 mL/(kg·d)腹腔注射；FNT及FMT組給予鹽酸川芎嗪注射液40mg/(kg·d)腹腔注射,各組注射均連續(xù)7天。各組小鼠在注射藥物7天后,禁食8 h,每組各抽取5只小鼠,摘眼球取血置于EDTA抗凝的采血管中,用于檢測CECs的值。剩余各組小鼠摘眼球取血置于促凝采血管中,分離血清,用于各組小鼠生化法檢測血脂、ELISA法檢測Hepcidin, NO, ET·1、ROS、 MDA, SOD, IL-1、 IL-6及TNF-a的表達。取血后分離小鼠主動脈與肝臟,將主動脈上端約0.5cm與肝左葉根據(jù)標準組織切片技術(shù),固定于4%多聚甲醛中,用于組織切片及HE染色,主動脈剩余部分放于-80℃C冰箱保存,用于組織鐵的檢測。結(jié)果：1.各組小鼠主動脈內(nèi)鐵含量的比較：與N組相比,M組、FM主動脈內(nèi)鐵含量均顯著增多(P0.05),FN組雖有變化的趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.1)；與M組相比,FM組小鼠主動脈內(nèi)鐵含量雖增多的趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.1)；與FM組相比,FMT組小鼠主動脈內(nèi)鐵含量明顯減少(P0.01)。2.各組小鼠血脂水平比較:與N組相比,M組、FM組與FMT組小鼠的血清膽固醇(TC)水平均顯著升高(P0.05)。與M組相比,FM組與FMT組的TC均無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.1),而各組的TG(甘油三酯)水平均無明顯變化(P0.05)。3.各組小鼠血清hepcidin的比較：與N組相比,M組、FM組與FMT組的血清hepcidin表達均顯著增多(P0.01),FN組略有升高,FNT組則無顯著變化(P0.1)。與M組相比,FM組的血清hepcidin表達增多(P0.05),而FMT組的血清hepcidin表達減少(P0.05)：與FM組相比,FMT組的血清hepcidin表達明顯減少(P0.01)。4.各組小鼠內(nèi)皮損傷相關(guān)指標的比較：與N組相比,M組、FM組與FMT組的血清ET-1水平顯著升高(P0.01),FN組略有升高,FNT組則無顯著變化(P0.1);與M組相比,FM組的血清ET-1水平升高(P0.05)；與FM組相比,FMT組的血清ET-1水平顯著降低(P0.01)。與N組相比,M組、FM組、FMT組與FN組的血清NO水平均顯著降低(P0.01),FNT組則無顯著變化(P0.1)；與M組相比,FM組的血清NO水平略有降低的趨勢(P0.1)；與FM組相比,FMT組的血清NO水平顯著升高(P0.01)5.各組小鼠氧化應激損傷相關(guān)指標的比較：與N組相比,M組、FM組與FMT組的血清ROS、 MDA水平均顯著升高(P0.01),FN組與FNT組的ROS水平存在變化的趨勢,MDA水平則無顯著變化,差異均無統(tǒng)計學意義(P0.1)；與M組相比,FM組的血清ROS、 MDA水平有升高的趨勢,但差異均無統(tǒng)計學意義(P0.1)；與FM組相比,FMT組的血清ROS、 MDA水平均顯著下降(P0.01)。與N組相比,M組、FM組、FMT組與FN組的血清SOD水平有不同程度下降(P0.05,P0.01),FNT組略有下降的趨勢(P0.1)；與M組相比,FM組的血清SOD水平下降(P0.05)；與FM組相比,FMT組的血清SOD水平略有升高的趨勢(P0.05)。6.各組小鼠炎癥因子水平的比較：與N組相比,M組、FM組與FMT組的血清IL-1、 IL-6及TNF-a水平均顯著升高(P0.01),FN組與FNT組的IL-6水平存在變化的趨勢,IL-1與TNF-a水平則無明顯變化,差異均無統(tǒng)計學意義(P0.1)；與M組相比,FM組的血清IL-1與TNF-a水平均顯著升高的趨勢(P0.01),FM組的血清IL-6水平略有升高的趨勢(P0.05)；與FM組相比,FMT組的血清IL-1、 IL-6及TNF-a水平均顯著下降(P0.01)7.各組小鼠肝組織病理變化：與N組相比,FN與FNT組未見明顯異常；M組及FM組肝小葉結(jié)構(gòu)欠清,明顯可見彌漫性大小不一的圓形脂肪空泡,伴有水樣變性、炎性細胞浸潤及凋亡的肝細胞,且FM組脂肪樣變更重；FMT組較FM組有明顯改善8.各組小鼠主動脈組織病理變化：與N組相比,FNT組未見明顯異常,FN組出現(xiàn)少量內(nèi)皮細胞脫落及輕度的結(jié)構(gòu)紊亂,M組及FM組胸主動脈組織均出現(xiàn)了明顯的內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)紊亂并有脫落,伴中膜增厚,且FM組內(nèi)皮損傷特征更加明顯。川芎嗪干預后FMT組胸主動脈內(nèi)皮組織結(jié)構(gòu)有明顯改善。9.各組小鼠外周血中的CECs變化：與N組相比,M組、FN組、FM組的CECs相對計數(shù)均升高(P0.01),與M組相比,FM組小鼠的CECs相對計數(shù)升高(P0.01)；與FM組相比,FMT組小鼠的CECs相對計數(shù)降低(P0.01)。小結(jié)：本研究結(jié)果提示,FPN1基因內(nèi)皮敲除可加重主動脈內(nèi)的鐵過載,引起并加重內(nèi)皮功能障礙、氧化應激與炎癥反應,且在機體高血脂狀態(tài)下表現(xiàn)更為顯著。高脂血癥狀態(tài)可引起血清hepcidin的表達增多與組織內(nèi)鐵過載,而川芎嗪可抑制hepcidin的高表達,減少組織內(nèi)鐵沉積,且對鐵過負荷的改善作用更加明顯。研究三高脂血癥小鼠hepcidin基因和肝臟內(nèi)p-Stat3與p-S mad 1/5/8表達變化目的：通過檢測小鼠肝臟中hepcidin基因的上游調(diào)控因子p-Smad1/5/8與p-Stat3的表達,探討高血脂狀態(tài)下小鼠肝臟p-Stat3與p-Smad1/5/8表達的變化與川芎嗪干預作用的機制。方法：C57BL／6小鼠24只,普通飼料適應性喂養(yǎng)1w后,隨機分為4組,每組6只,其中2組以普通飼料喂養(yǎng)4周,剩余2組以高脂飼料喂養(yǎng)4周,建立高脂血癥模型。喂養(yǎng)4周后,將以普通飼料喂養(yǎng)的2組小鼠隨機分為空白對照組(N)及普食川芎嗪組(NT),以高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠隨機分為高脂模型組(M)及高脂+川芎嗪組(MT)。N及M組給予生理鹽水2 mL/(kg-d)腹腔注射；NT及MT組給予鹽酸川芎嗪注射液40mg/(kg-d)腹腔注射,各組注射均連續(xù)7天。各組小鼠在注射藥物7天后,禁食8 h,摘眼球取血分離血清后用于hepcidin與生化的檢測。分離小鼠肝臟,將肝左葉根據(jù)標準組織切片技術(shù),固定于4%多聚甲醛中,用于組織切片及HE染色,剩余部分置于凍存管內(nèi)迅速放入液氮中,后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存,用于p-Smad1/5/8與p-Stat3蛋白表達的檢測。結(jié)果：1.各組小鼠血脂水平比較：與N組相比,NT組的TC的水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.1),而M組及MT組的血清TC均明顯升高(P0.01)；與N組相比,各組的TG的水平均無明顯改變(P0.1)。2.各組小鼠血清hepcidin的比較：與N組相比,NT組血清hepcidin表達有減少的趨勢,但差異無顯著統(tǒng)計學意義(0.1P0.05),M組血清hepcidin的表達則增多(P0.01)。與M組相比,MT組的血清hepcidin表達明顯減少(P0.01) 。3.小鼠肝組織病理變化：與N組相比,NT組未見明顯異常；M肝組織小葉結(jié)構(gòu)欠清,明顯可見彌漫性大小不一的圓形脂肪空泡,伴有水樣變性、炎性細胞浸潤及凋亡的肝細胞；MT組較M組有明顯改善。4.各組小鼠肝組織p-Stat3蛋白的表達情況：與N組相比,NT組p-Stat3蛋白表達明顯減少(P0.05),M組的p-Stat3蛋白表達增多(P0.05)。與M組相比,MT組p-Stat3蛋白表達明顯減少(P0.05)。5.各組小鼠肝組織p-Smad1/5/8蛋白的表達情況：各組小鼠肝組織p-Smad1/5/8蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與N組相比,M組的p-Smad1/5/8蛋白表達有增多的趨勢(P0.1)。與M組相比,N組、NT組與MT組p-Smad1/5/8蛋白表達均可見減少的趨勢(P0.05)。小結(jié)：高血脂狀態(tài)下p-Stat3蛋白表達量增加,相應hepcidin基因表達也上調(diào),但p-Smadl/5/8無明顯變化,川芎嗪可抑制p-Stat3蛋白表達,hepcidin基因表達隨之下調(diào),故推測高血脂狀態(tài)通過激活JAK/STAT途徑促進了hepcidin的表達,而川芎嗪下調(diào)hepcidin的表達可能是通過抑制JAKs磷酸化STAT3(JAK/STAT途徑)來實現(xiàn)的。結(jié)論本研究結(jié)果提示高血脂可能通過引起血清hepcidin表達增多參與了高脂血癥繼發(fā)血管內(nèi)皮損傷的發(fā)生發(fā)展過程,通過觀察高血脂狀態(tài)下小鼠肝臟p-Stat3蛋白表達的變化,推測高血脂狀態(tài)是通過激活JAK/STAT途徑促進了hepcidin的表達。并借助FPN1基因內(nèi)皮敲除(FPN1 Tek-cre)小鼠研究,發(fā)現(xiàn)FPN1基因內(nèi)皮敲除可加重主動脈內(nèi)的鐵過載,引起并加重內(nèi)皮功能障礙、氧化應激與炎癥反應,且在機體血脂代謝異常的情況下表現(xiàn)更為顯著。而川芎嗪的干預可抑制hepcidin的高表達,減少組織內(nèi)鐵沉積,推測這是其保護血管內(nèi)皮細胞的作用機制之一。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R543.5

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本文編號：1519691