發(fā)布時間：2017-09-26 03:21

  本文關鍵詞：成人原代肝細胞的分離、鑒定及其蛋白質(zhì)合成與P450表達

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【摘要】：目的:探討手術切除的成人良性病變肝葉的肝細胞分離及細胞鑒定技術,研究成人原代肝細胞培養(yǎng)過程中的細胞活力的改變,及蛋白質(zhì)合成與細胞色素P450表達的變化。方法:選擇肝臟良性病變的手術切除肝葉標本,采用改良膠原酶灌注分離法分離肝細胞,用血球計數(shù)板計數(shù)法對分離后的新鮮肝細胞計數(shù),臺盼藍拒染法檢測新鮮肝細胞活率;利用過碘酸-schiff(PAS)反應來檢測肝細胞的糖原合成能力,并利用免疫組織化學方法來測定肝細胞角蛋白CK18的表達聯(lián)合判斷肝細胞純度;用CCK-8法檢測連續(xù)培養(yǎng)7d肝細胞的細胞活力;全自動生化分析儀檢測成人原代肝細胞在培養(yǎng)過程的白蛋白、尿素合成及相關生化功能指標;應用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測體外培養(yǎng)肝細胞細胞色素P450表達(生物轉(zhuǎn)化反應第一相反應)。結(jié)果:1.新鮮分離的成人原代肝細胞數(shù)目大于109個,臺盼藍拒染法檢測肝細胞活率達90%或以上。2.培養(yǎng)24小時后,肝細胞PAS糖原染色發(fā)現(xiàn)成人原代肝細胞內(nèi)糖原被染成紅色顆�；蚱瑺�,抗細胞角蛋白CK-18免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)CK-18在肝細胞內(nèi)均勻分布,被染成棕黃色;糖原染色及細胞角蛋白CK-18聯(lián)合鑒定肝細胞純度達95%以上。3.CCK-8實驗結(jié)果顯示肝細胞培養(yǎng)第三天細胞活力處于最佳狀態(tài)。4.培養(yǎng)的1周的過程中,肝細胞均具有良好的合成糖原、白蛋白和尿素的功能。5.培養(yǎng)過程中,ALT、AST、LDH的泄漏率呈下降后上升的趨勢,在培養(yǎng)3天時達到最低,培養(yǎng)4天時開始上升,白蛋白的分泌量和尿素合成量在培養(yǎng)3天時達到最高,培養(yǎng)4天時開始下降。6.在離體培養(yǎng)1-7天中,肝細胞在80KD處均可見有細胞色素P450表達,并且在第3天表達最好。結(jié)論:1.改良膠原酶灌注分離法分離肝細胞操作步驟簡單,得到的肝細胞數(shù)目多、純度高且具有完善的細胞功能。2.本研究所示肝細胞的細胞活力及細胞的生化性質(zhì)均在培養(yǎng)的第3天時達到最好的狀態(tài)。3.在離體培養(yǎng)1周的過程中,成人原代肝細胞均具有很好的細胞色素P450表達功能,且在第3天表達最好。
【關鍵詞】：成人原代肝細胞 鑒定 P450表達
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 引言10-14
• 第二章 材料與實驗方法14-24
• 2.1 實驗材料14-17
• 2.1.1 研究對象14-15
• 2.1.2 主要實驗用的試劑及來源15
• 2.1.3 常用工作液的配制15-16
• 2.1.4 主要實驗儀器及耗材16-17
• 2.2 實驗方法17-24
• 2.2.1 成人原代肝細胞的分離及活率測定17-18
• 2.2.2 成人原代肝細胞的鑒定及純度檢測18-20
• 2.2.2.1 新鮮分離的成人原代肝細胞形態(tài)學觀察18
• 2.2.2.2 PAS法檢測肝細胞內(nèi)糖原合成能力18-19
• 2.2.2.3 免疫組織化學法測定肝細胞角蛋白CK18的表達 （10）19-20
• 2.2.3 成人原代肝細胞的培養(yǎng)20-21
• 2.2.3.1 培養(yǎng)過程中肝細胞形態(tài)及生長狀況觀察20
• 2.2.3.2 用CCK8法檢測培養(yǎng)過程中肝細胞活力變化20
• 2.2.3.3 成人原代肝細胞在體外培養(yǎng)過程中生化指標的變化20-21
• 2.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測肝細胞色素 P450 活性21-24
• 第三章 實驗結(jié)果24-32
• 3.1 成人原代肝細胞的分離及活率的測定24
• 3.2 成人原代肝細胞的鑒定及純度檢測24-26
• 3.2.1 倒置顯微鏡下觀察新鮮分離的成人原代肝細胞形態(tài)24-25
• 3.2.2 PAS法檢測肝細胞內(nèi)糖原合成能力25
• 3.2.3 免疫組織化學方法測定肝細胞角蛋白CK18的表達25-26
• 3.3 成人原代肝細胞培養(yǎng)過程中活力及生化功能檢測26-30
• 3.3.1 原代肝細胞培養(yǎng)過程的形態(tài)學觀察26-27
• 3.3.2 CCK8 法檢測成人原代肝細胞培養(yǎng)過程中的細胞活力變化27-28
• 3.3.3 成人原代肝細胞在體外培養(yǎng)過程中生化指標的變化 （19）28-30
• 3.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測肝細胞色素 P450 活性30-32
• 第四章 討論32-36
• 第五章 結(jié)論36-37
• 參考文獻37-41
• 綜述41-51
• 參考文獻47-51
• 在讀期間發(fā)表的主要學術論文及參與課題51-52
• 致謝52

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：921177