本文關(guān)鍵詞：基于腺相關(guān)病毒載體的人工miRNA抗乙型肝炎病毒基因治療研究

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【摘要】：乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)引起的傳染病。HBV感染是一個(gè)非常嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題,是嚴(yán)重危害人類健康的重大傳染病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球大約有3.5億慢性HBV感染者,每年全球大約有100萬人死于與HBV感染相關(guān)的疾病,包括肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌等。中國(guó)是乙型病毒性肝炎的高流行地區(qū),人群感染率高,在某些地區(qū)感染率高達(dá)35%以上,給國(guó)家?guī)沓林氐纳鐣?huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。我國(guó)HBV攜帶者約9300萬人,其中慢性乙肝患者高達(dá)2500萬,是我國(guó)最為嚴(yán)重的三大傳染病之一,也是我國(guó)肝細(xì)胞癌(HCC)高發(fā)的重要原因。目前臨床上對(duì)乙肝病毒感染的主要治療藥物包括干擾素、核苷及核苷酸類似物等,但是這些藥物只能在少數(shù)慢性感染患者中產(chǎn)生長(zhǎng)期應(yīng)答,并不能徹底清除乙肝病毒,并且也存在著復(fù)發(fā)率高、藥物毒副作用較大和藥品價(jià)格昂貴等問題,因此發(fā)展慢性乙肝新的治療策略仍是醫(yī)學(xué)上面臨的巨大挑戰(zhàn)�；蛑委熥鳛樯锛夹g(shù)新的里程碑,是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主方向之一,曾被Science雜志評(píng)為2009年10大科學(xué)突破之一,而其中值得關(guān)注的是,重組腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)載體在治療先天性黑蒙病中及B型血友病等疾病的基因治療臨床試驗(yàn)中取得了突破性的進(jìn)展,第一個(gè)用于治療脂蛋白脂酶缺乏遺傳病(LPLD)的AAV載體介導(dǎo)的基因治療藥物Glybera已在歐美國(guó)家批準(zhǔn)上市。AAV以其低致病性、低免疫原性、能導(dǎo)致外源基因長(zhǎng)期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)被視為最具有開發(fā)潛質(zhì)的病毒載體之一。而根據(jù)多篇文章報(bào)道,在眾多AAV血清型中,8型腺相關(guān)病毒(AAV-8)對(duì)肝臟細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高,是肝臟疾病基因治療常用載體。miRNA是一類由內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄加工形成的長(zhǎng)約21 nt的小分子單鏈RNA,是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)Dicer酶加工后生成,在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。人工miRNA (artificial miRNA, amiRNA)是指將天然miRNA的成熟序列替換為人工設(shè)計(jì)的靶向某一基因的反義序列,可模擬內(nèi)源miRNA的作用機(jī)制人為地沉默目的基因,由于amiRNA利用了miRNA的天然生成途徑,同時(shí)相對(duì)于shRNA具有干擾效果更好、體內(nèi)毒性更低等優(yōu)點(diǎn)而逐漸成為研究的新熱點(diǎn)。本課題應(yīng)用8型腺相關(guān)病毒載體攜帶三個(gè)串聯(lián)表達(dá)的amiRNA進(jìn)行抗HBV的基因治療研究。本課題第一部分探索了應(yīng)用肝靶向性較好的AAV-8載體介導(dǎo)3個(gè)串聯(lián)表達(dá)的amiRNA對(duì)乙肝模型小鼠體內(nèi)HBV抑制作用的研究。本課題組成員在前期研究中構(gòu)建了3條靶向不同基因型HBV的基因組保守區(qū)并去除任何靶向人和小鼠非特異序列的amiRNA,實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)HBsAg和HBeAg勻有顯著的抑制效果且3個(gè)串聯(lián)表達(dá)的amiRNA較單個(gè)的amiRNA有更高的抑制HBV復(fù)制的作用。本研究中,我們構(gòu)建了攜帶肝特異性啟動(dòng)子的3個(gè)串聯(lián)amiRNA的rAAV表達(dá)質(zhì)粒并命名為pAAV-liver-amiRNA135,通過將pAAV-liver-amiRNA135與不同基因型HBV表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,在體外證明其對(duì)不同基因型HBV的HBsAg、HBeAg的表達(dá)以及HBV DNA的復(fù)制均有顯著抑制作用(p0.01)。接著,我們將pAAV-liver-amiRNA135包裝成與質(zhì)粒相比對(duì)肝臟細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高的重組腺相關(guān)病毒載體即AAV8-amiRNA135,然后對(duì)其進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià),為后期較深入的臨床前研究和臨床研究提供參考。首先,我們利用乙肝病毒低復(fù)制轉(zhuǎn)基因小鼠聯(lián)合水動(dòng)力注射HBV表達(dá)質(zhì)粒以維持小鼠肝內(nèi)HBV長(zhǎng)期高復(fù)制表達(dá)的方法構(gòu)建了肝內(nèi)HBV高復(fù)制的乙肝模型鼠并進(jìn)行AAV8-amiRNA135的梯度藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。將AAV8-amiRNA135以5×1011vg/只、5×1010vg/只、5×109vg/只、5×108vg/只經(jīng)尾靜脈分別注射模型小鼠,并以注射5×1011vg/只攜帶不靶向人類及老鼠任何基因的amiRNA序列的AAV8-Neg為陰性對(duì)照組,以注射5×1011vg/只攜帶雙熒光素酶基因的AAV8-luc載體為空白對(duì)照組,在注射后不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)采靜脈血,用定量ELISA方法檢測(cè)血清中HBsAg及HBeAg的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,AAV8-amiRNA135對(duì)乙肝模型小鼠血清HBsAg及HBeAg的抑制效果具有劑量依賴性,尤其是注射5×1011vg/只AAV8-amiRNA135的乙肝模型小鼠血清中HBsAg、 HBeAg;表達(dá)水平顯著下降,甚至接近陰性水平。更重要的是,我們發(fā)現(xiàn)單次尾靜脈注射AAV8-amiRNA135能有效抑制HBV復(fù)制至少15個(gè)月。接著,我們通過頸椎脫臼法處死小鼠,提取肝臟組織乙肝病毒核心顆粒DNA來檢鋇HBV DNA的拷貝數(shù)水平,結(jié)果顯示,肝臟組織中HBVDNA拷貝數(shù)隨著該病毒載體注射劑量的增大而顯著降低(p0.01),說明了amiRNA135的表達(dá)能有效抑制肝內(nèi)HBVDNA的復(fù)制。此外,我們對(duì)肝臟組織進(jìn)行了HE染色及針對(duì)乙肝表面抗原HBsAg和核心抗原HBcAg的免疫組織化學(xué)染色。HE染色結(jié)果顯示,陰性對(duì)照組小鼠肝組織切片可見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝炎病理特征較明顯；注射5×109vg AAV8-amiRNA135小鼠肝臟組織與陰性對(duì)照組相比,炎癥細(xì)胞相對(duì)較少,有較為整齊的肝小葉結(jié)構(gòu)；注射劑量為5×1010vg及5×1011vgAAV8-amiRNA135的小鼠,肝細(xì)胞形態(tài)正常,肝小葉排列整齊且無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),說明注射劑量為5x1010vg及5×1011Vg的AAV8-amiRNA135能有效抑制肝炎反應(yīng)且無明顯肝毒性。通過免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肝臟組織中HBsAg和HBcAg的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,肝臟組織中HBsAg和HBcAgP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均隨著AAV8-amiRNA135注射劑量的增大而減少,說明AAV8-amiRNA135對(duì)乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中HBsAg,及HBcAg的表達(dá)均有顯著抑制作用,且抑制效果具有劑量依賴性。后續(xù)隨著實(shí)驗(yàn)室高復(fù)制乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠模型的成功構(gòu)建,我們進(jìn)一步研究比較了AAV8-amiRNA135對(duì)不同品系的高復(fù)制乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠的抗HBV作用。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠選擇了三個(gè)品系,分別為C16-4♀、2C♂和2B♂、2B♀。將AAV8-amiRNA135以5×10¨vg/只經(jīng)尾靜脈分別注射以上小鼠,以注射5×1011vg/只的AAV8-Neg為陰性對(duì)照組,在注射后第1、2、3周采靜脈血檢測(cè)血清中HBsAg及HBeAg的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,AAV8-amiRNA135對(duì)三個(gè)品系的乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠均有較好的抑制作用,其對(duì)血清中HBsAg的抑制效率均達(dá)到80%-90%,對(duì)HBeAg的抑制效率也達(dá)到40%-70%。注射病毒載體后第4周,通過頸椎脫臼法處死小鼠,對(duì)肝臟組織HBV DNA及HBV RNA拷貝數(shù)水平進(jìn)行定量檢測(cè),結(jié)果顯示,注射AAV8-amiRNA135的乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中HBV DNA及HBV RNA拷貝數(shù)均顯著低于陰性對(duì)照組(p0.05),說明了amiRNA135的表達(dá)能有效抑制不同品系乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織中HBVDNA及RNA的復(fù)制。綜上所述,這一部分研究所構(gòu)建的AAV8-amiRNA135載體對(duì)HBV具有廣泛而顯著的抑制作用,且單次載體灌注能有效發(fā)揮抑制作用至少15個(gè)月,本研究結(jié)果為慢性乙肝的基因治療開辟了新路徑。為進(jìn)一步提高AAV介導(dǎo)的肝臟疾病基因治療效率,本課題第二部分和第三部分內(nèi)容旨在探索肝靶向性更高的重組腺相關(guān)病毒載體。在目前發(fā)現(xiàn)的眾多AAV血清型中,已知AAV-8是肝臟基因治療最常用的載體之一；AAV-DJ是將8種不同血清型AAV的衣殼基因通過DNA shuffling技術(shù)得到的嵌合型AAV載體,具有與AAV-8相同的肝靶向性且人體內(nèi)存在的AAV抗體對(duì)它的中和性較低,因此也被認(rèn)為是人類肝臟疾病基因治療理想的載體之一。但盡管如此,AAV在肝臟基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的應(yīng)用還具有一定的挑戰(zhàn)性,例如,機(jī)體對(duì)AAV衣殼蛋白的免疫排斥、泛素蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解途徑均能使AAV在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生降解,從而降低其介導(dǎo)的基因傳遞效率。因此,為了降低AAV的免疫源性及胞內(nèi)降解率,需要進(jìn)一步優(yōu)化AAV載體,從而提高其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,對(duì)AAV衣殼蛋白表面特定的磷酸化/泛素化殘基(如酪氨酸,賴氨酸,絲蘇氨酸等)進(jìn)行突變能進(jìn)一步提高其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,原因是這些位點(diǎn)突變后能阻斷下游的泛素化介導(dǎo)的蛋白降解,從而提高AAV載體介導(dǎo)外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效率。我們首先利用磷酸化/泛素化位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件,選定了三個(gè)AAV8的突變位點(diǎn)和三個(gè)AAV-DJ的突變位點(diǎn),然后利用overlap-PC R方法進(jìn)行定點(diǎn)突變,構(gòu)建了三個(gè)AAV8的突變體：Y447F、Y703F和Y708F,以及三個(gè)AAV-DJ的突變體：K137,T251A, S503A。通過PEI轉(zhuǎn)染法將突變的cap質(zhì)粒、病毒包裝輔助質(zhì)粒pAAV-Helper及外源基因表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝成表達(dá)GFP基因和/或雙熒光素酶Gluc-Fluc基因的重組AAV載體。首先將表達(dá)雙熒光素酶Gluc-Fluc基因的重組野生型AAV-8及其三個(gè)酪氨酸突變體(Y447F、Y703F和Y708F)以1×1010vg注射6-8周齡的C57BL/6小鼠,在注射后第7、14、21、28天取尾靜脈血檢鋇Gluc的表達(dá),結(jié)果顯示,Y703F突變體介導(dǎo)Gluc的相對(duì)表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)均顯著高于野生型AAV8約3-4倍(P0.05)。注射42天后麻醉小鼠,利用活體成像方法檢測(cè)各載體的體內(nèi)靶向性,結(jié)果顯示,三種突變體均具有肝靶向性,與野生型AAV-8一致,且Y703F介導(dǎo)的Fluc在肝臟組織中的平均光強(qiáng)度顯著高于野生型AAV-8約2倍(P0.01)�；铙w成像實(shí)驗(yàn)后處死小鼠,提取各組織DNA,調(diào)整上樣DNA模板至相同濃度,用QPCR方法檢測(cè)Fluc DNA的水平,結(jié)果顯示,在肝臟組織中,四種載體介導(dǎo)的Fluc DNA拷貝數(shù)在106～107GC (genomecopy) /100ng總DNA,而在其他組織,例如腎臟、心臟及肌肉組織,四種載體介導(dǎo)的Fluc的DNA拷貝數(shù)則低至105～106GC/100ng ,總DNA,進(jìn)一步說明了三個(gè)酪氨酸突變體的肝靶向性沒有改變,而且Y703F突變體介導(dǎo)的Fluc對(duì)小鼠肝臟、腎臟及肌肉的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率均高于野生型AAV-8約3-7倍(P0.01)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該突變體的有效性,我們還比較了攜帶治療性基因血管緊張素1-7 (Angiotemin 1-7 ,Ang (1-7))的wtAAV-8及其Y703F突變體在C57BL/6小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,將兩種病毒以1×1011vg經(jīng)尾靜脈分別注射小鼠,以注射1×1011vg Y703F-Luc為陰性對(duì)照組,在注射后第7,14,21,28天檢測(cè)血清中Ang(1-7)的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,Y703F介導(dǎo)的Ang(1-7)表達(dá)水平從第14天開始顯著高于wtAAV-8約2倍(p0.01)；肝組織DNA拷貝數(shù)分析結(jié)果顯示,Y703F介導(dǎo)的Ang(1-7)在肝臟的DNA拷貝數(shù)顯著高于wtAAV-8約3倍(p0.001)。因此我們得出,對(duì)AAV-8衣殼蛋白703位點(diǎn)上的酪氨酸殘基進(jìn)行突變能有效提高其對(duì)肝臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,且該突變體具有與wtAAV-8相一致的肝靶向性。同樣地,我們將表達(dá)雙熒光素酶Gluc- F luc基因的AAV-DJ及其三個(gè)突變體(K137R, T251A, $503A)以l×1011vg注射6-8周齡的C57BL/6小鼠,在注射后第7、14、21、28天取尾靜脈血檢鋇Gluc的表達(dá),結(jié)果顯示,S503A突變體介導(dǎo)Gluc的相對(duì)表達(dá)量在不同的時(shí)間點(diǎn)均高于AAV-DJ約3倍(P0.01)。注射42天后麻醉小鼠,利用活體成像方法檢測(cè)各載體的體內(nèi)靶向性,結(jié)果顯示,三種突變體均具有肝靶向性,與AAV-DJ一致。活體成像實(shí)驗(yàn)后處死小鼠,提取各組織DNA,調(diào)整上樣DNA模板至相同濃度,用QPCR方法檢鋇Fluc DNA的水平,結(jié)果顯示,在肝臟組織中,四種載體介導(dǎo)的Fiuc的DNA拷貝數(shù)在107～108 GC/100ng總DNA,而在腎臟、心臟、胰臟、肺、腦及肌肉組織,四種病毒載體介導(dǎo)的Fluc的DNA拷貝數(shù)則低至105～107 GC/100ng總DNA,進(jìn)一步說明了三個(gè)突變體仍保持肝靶向性,而且S503A突變體介導(dǎo)的Fluc對(duì)小鼠肝臟、心臟及肌肉的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率均顯著高于AAV-DJ約3倍(P0.05)。然而,在體外實(shí)驗(yàn)中,我們將表達(dá)GFP基因的AAV-DJ及其三個(gè)突變載體以MOI=1000感染三種不同類型的細(xì)胞：293T、Hela和HepG2細(xì)胞,感染后48h檢測(cè)四種病毒載體介導(dǎo)GFP對(duì)三種不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,結(jié)果顯示,K137R和S503A突變體介導(dǎo)的GFP對(duì)三種細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率稍高于AAV-DJ約20%-30%(p0.05),而T251A突變體則無明顯差異。因此我們得出,雖然體外感染效率只有稍微的提高,但AAV-DJ衣殼蛋白503位點(diǎn)上的絲氨酸殘基進(jìn)行突變能夠有效提高其對(duì)小鼠體內(nèi)肝臟、心臟及肌肉的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,具有重要應(yīng)用意義。綜合本課題的三部分研究?jī)?nèi)容,我們主要取得了以下成果：1、本研究所研發(fā)的AAV8-amiRNA具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán),實(shí)驗(yàn)證明該候選藥物能在乙肝模型動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá),從而達(dá)到長(zhǎng)期穩(wěn)定抑制HBV復(fù)制的作用。利用AAV-8作為載體攜帶3個(gè)串聯(lián)表達(dá)的amiRNA在乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)表達(dá),能有效抑制小鼠血清中HBsAg, HBeAg水平并顯著降低肝臟HBsAg、HBcAg的表達(dá)水平以及HBVRNA, DNA的拷貝數(shù)；一次尾靜脈注射能穩(wěn)定發(fā)揮抑制作用至少15個(gè)月；對(duì)不同品系乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠均具有廣泛而顯著的抑制作用,該候選藥物為乙肝的基因治療開辟了新路徑；2、通過overlapping-PCR方法對(duì)AAV-8衣殼蛋白進(jìn)行單點(diǎn)突變,構(gòu)建了三個(gè)AAV8的酪氨酸突變體(Y447F、Y703F、Y708F),體內(nèi)結(jié)果顯示,Y703F突變能顯著提高其對(duì)小鼠肝臟、腎臟及肌肉的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率且具有與wtAAV-8一致的肝靶向性；3、同樣方法構(gòu)建了三個(gè)AAV-DJ的突變體(K137R、 T251A, S503A),雖然體外結(jié)果顯示四個(gè)病毒載體對(duì)293T、Hela及HepG2細(xì)胞的感染效率差異較小,但體內(nèi)結(jié)果顯示,S503A突變能顯著提高其對(duì)小鼠肝臟、心臟及肌肉的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,且同樣具有較好的肝靶向性。以上結(jié)果為肝臟疾病的基因治療提供新線索。
【關(guān)鍵詞】：重組腺相關(guān)病毒載體 點(diǎn)突變 人工miRNA 乙肝 基因治療
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.62;R450
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-34
• 參考文獻(xiàn)27-34
• 第一章 AAV8介導(dǎo)amiRNA抑制乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV復(fù)制34-68
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料35-37
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法37-47
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析47-48
• 1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-63
• 1.5 討論63-65
• 1.6 參考文獻(xiàn)65-68
• 第二章 衣殼蛋白表面磷酸化位點(diǎn)突變提高AAV-8的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率68-91
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料69-70
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法70-78
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析78
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果78-86
• 2.5 討論86-88
• 2.6 參考文獻(xiàn)88-91
• 第三章 衣殼蛋白表面磷酸化位點(diǎn)突變提高AAV-DJ的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率91-113
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料91-93
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法93-101
• 3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析101
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果101-109
• 3.5 討論109-111
• 3.6 參考文獻(xiàn)111-113
• 全文總結(jié)113-115
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文115-116
• 英文縮寫116-117
• 致謝117-118

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8 楊衛(wèi)忠;陳春美;王春華;石松生;黃勇;李青;羅望池;蔡冬生;;誘導(dǎo)型一氧化氮合酶反義RNA重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建[J];福建醫(yī)藥雜志;2008年01期

9 楊民;王強(qiáng);王劍;;重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子121的腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建及誘導(dǎo)體內(nèi)血管生成的實(shí)驗(yàn)研究[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2010年12期

10 李欣燕;許瑞安;王廣基;馬宏;謝海棠;趙小辰;陳淼;;大鼠星狀細(xì)胞激活相關(guān)蛋白基因的克隆及其重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建[J];藥物生物技術(shù);2005年06期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 陳遷;胡維新;羅賽群;曾趙軍;;重組腺相關(guān)病毒載體pAAV/TRE/HSVtk/tet-On的構(gòu)建及包裝的研究[A];湖南省生理科學(xué)會(huì)新世紀(jì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2002年

2 譚孟群;;腺相關(guān)病毒載體研究進(jìn)展[A];湖南省生理科學(xué)學(xué)會(huì)2004年度學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2004年

3 趙衛(wèi)紅;王笑云;吳劍卿;;自身互補(bǔ)腺相關(guān)病毒載體:包裝容量及其純度[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)腎臟病學(xué)分會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2006年

4 林世斌;;大鼠生長(zhǎng)相關(guān)蛋白基因重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)眼科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2007年

5 米亞非;郭豫濤;李小鷹;;重組1、2型腺相關(guān)病毒載體在小鼠心臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)第十次全國(guó)心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議匯編[C];2008年

6 陳騰;徐淑軍;李新鋼;;Tet-Off腺相關(guān)病毒載體基因表達(dá)調(diào)控體系的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

7 陳慧;李體遠(yuǎn);朱鵬立;余福玲;阮景明;吳小盈;杜珙;戴勇;;人組織型激肽釋放酶基因?qū)θ四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì)第八次全國(guó)心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議匯編[C];2004年

8 楊敏;王鎖英;許小朋;王勝軍;邵啟祥;許化溪;;人T-bet基因重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建[A];2006中國(guó)微生物學(xué)會(huì)第九次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2006年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 記者 白毅;新基因載體為股骨頭壞死患者帶來希望[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2010年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 毛瑩瑩;基于腺相關(guān)病毒載體的人工miRNA抗乙型肝炎病毒基因治療研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

2 徐增輝;腺相關(guān)病毒載體大規(guī)模生產(chǎn)系統(tǒng)的建立其機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

3 董小巖;新型腺相關(guān)病毒載體及應(yīng)用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

4 吳劍卿;新型高效重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及其在肺癌基因治療中的應(yīng)用研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2006年

5 李江;PLB基因反義RNA腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)糖尿病大鼠心力衰竭的療效[D];浙江大學(xué);2005年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 劉麗玉;睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建[D];福建醫(yī)科大學(xué);2005年

2 陳鯉敏;睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和綠色熒光蛋白共表達(dá)的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建[D];福建醫(yī)科大學(xué);2009年

3 林世斌;大鼠生長(zhǎng)相關(guān)蛋白基因重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建[D];福建醫(yī)科大學(xué);2006年

4 阮景明;激肽釋放酶腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及其在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)[D];福建醫(yī)科大學(xué);2004年

5 藍(lán)丹鋒;GAP-43和紅色熒光蛋白融合基因重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及表達(dá)[D];福建醫(yī)科大學(xué);2006年

6 袁亞麗;靶向14-3-3ζ基因siRNA的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建與表達(dá)[D];華南理工大學(xué);2011年

7 陳曉斌;重組人HIF-1α反義RNA腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建和鑒定[D];福建醫(yī)科大學(xué);2007年

8 陳德杰;人Angiopoietin1和VEGF基因AAV共表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建[D];武漢大學(xué);2004年

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本文編號(hào)：826400