本文關(guān)鍵詞：醋氨酚誘導(dǎo)小鼠急性藥物性肝損傷中HNF-1調(diào)節(jié)GSTA1表達分析

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【摘要】：藥物在使用過程中由于其本身或代謝產(chǎn)物會所導(dǎo)致肝臟的損傷,也可能由于患者體質(zhì)對藥物的敏感性比較強烈易導(dǎo)致肝臟損傷。由于醋氨酚(APAP)普遍存在于市面上各種解熱鎮(zhèn)痛藥中,使其成為藥物性肝損傷比較理想并具有實際應(yīng)用意義的實驗?zāi)Ｐ汀９入赘孰腟轉(zhuǎn)移酶A1(GSTA1)是有機體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化中最重要的Ⅱ相代謝酶之一,主要作用是防止細胞受到氧化損傷,亦能抵抗癌變反應(yīng),其對外來毒性物質(zhì)和活性氧的解毒作用已經(jīng)成為一種重要的抗氧化應(yīng)激的細胞機制。肝細胞核因子-1(HNF-1)是一類在肝臟中表達較多的調(diào)節(jié)因子,能夠調(diào)節(jié)肝細胞基因特異性表達,其分子結(jié)構(gòu)上含有一段相當保守的DNA結(jié)合區(qū),HNF-1對靶基因表達的調(diào)節(jié)正是通過該區(qū)域與各種靶基因調(diào)控區(qū)的順式作用元件結(jié)合而實現(xiàn)的,從而使HNF-1在轉(zhuǎn)錄水平上對肝細胞的分化和代謝過程發(fā)揮著重要的作用。本課題在急性藥物性肝損傷小鼠模型基礎(chǔ)上,通過比較應(yīng)用C2-神經(jīng)酰胺和奧替普拉(Oltipraz)對HNF-1表達進行抑制和促進兩種情況下,對肝組織中GSTA1表達的影響,明確HNF-1對GSTA1的表達的調(diào)節(jié)作用,為全面的認識GSTA1在急性藥物性肝損傷中的重要作用,深入研究其作用機制提供理論基礎(chǔ)和試驗依據(jù)。采用本課題組前期建立的方法復(fù)制并確認APAP誘導(dǎo)的急性藥物性肝損傷小鼠模型,通過對血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)活性、肝組織指標(SOD、MDA、GSH、GSH-Px)水平及肝組織中GSTA1的含量的檢測來判斷肝臟是否損傷,并結(jié)合肝組織病理學(xué)進行分析。在肝損傷模型基礎(chǔ)上,血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)活性作為評價指標來篩選確定C2-神經(jīng)酰胺和奧替普拉的給藥途徑及最適的給藥濃度。將C2-神經(jīng)酰胺與奧替普拉應(yīng)用于肝損傷模型中,實驗小鼠隨機分為六組,即空白對照組(對照組)、APAP模型組(模型組)、C2-神經(jīng)酰胺組(C2組)、C2-神經(jīng)酰胺+APAP組(C2+AP組)、奧替普拉組(OL組)、奧替普拉+APAP組(OL+AP組),運用試劑盒檢測血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)活性、肝組織指標(SOD、MDA、GSH、GSH-Px)水平,并對肝臟進行組織病理學(xué)分析;采用RT-PCR方法檢測肝組織中HNF-1和GSTA1的m RNA表達,應(yīng)用Western blot方法測定肝組織中HNF-1和GSTA1的蛋白表達水平,并運用ELISA法檢測肝組織中GSTA1的含量變化。綜合以上研究,明確C2-神經(jīng)酰胺對HNF-1的抑制作用及奧替普拉對HNF-1的促進作用,分析在C2-神經(jīng)酰胺和奧替普拉雙向調(diào)節(jié)HNF-1作用下對小鼠體內(nèi)GSTA1的影響,確定急性藥物性肝損傷中HNF-1對GSTA1表達的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果表明:(1)給小鼠灌胃劑量為200 mg·kg-1的APAP溶液,染毒12 h可成功復(fù)制小鼠急性藥物性肝損傷模型。病理組織學(xué)可見細胞破損,核固縮,肝細胞索模糊不清,廣泛地出現(xiàn)炎性細胞浸潤及出血點;兩種血清轉(zhuǎn)氨酶活性均極顯著高于對照組(p0.01);肝組織指標(SOD、MDA、GSH、GSH-Px)水平均極顯著改變(p0.01);肝臟中GSTA1含量極顯著減少(p0.01)。(2)通過給藥途徑和最適濃度篩選試驗,確定C2-神經(jīng)酰胺以120μmol·L-1濃度、奧替普拉以150μmol·L-1濃度灌胃給予小鼠。(3)C2-神經(jīng)酰胺和奧替普拉在肝損傷模型中應(yīng)用結(jié)果顯示,與對照組相比,C2組和OL組血清轉(zhuǎn)氨酶、肝組織指標及病理組織學(xué)均無顯著變化,說明所篩選C2-神經(jīng)酰胺和奧替普拉濃度不會造成肝損傷。與模型組相比,C2+AP組兩種血清轉(zhuǎn)氨酶活性均極顯著升高(p0.01),肝組織指標呈極顯著變化(p0.01),病理組織學(xué)顯示存在大量壞死細胞,肝細胞索模糊,炎性細胞浸潤現(xiàn)象嚴重并出現(xiàn)大量出血點,表明C2-神經(jīng)酰胺會加重APAP誘導(dǎo)的肝損傷;OL+AP組血清轉(zhuǎn)氨酶活性則極顯著降低(p0.01),肝組織指標也呈極顯著變化(p0.01),病理組織學(xué)顯示僅有少量的炎性細胞浸潤及細胞核固縮,表明奧替普拉在小鼠體內(nèi)能減輕APAP誘導(dǎo)的肝損傷。(4)HNF-1的表達結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組中HNF-1的m RNA和蛋白表達水平均極顯著降低(p0.01),C2組和OL組均無顯著變化;與模型組相比,C2+AP組中HNF-1的表達水平極顯著降低(p0.01)而OL+AP組極顯著升高(p0.01)。以上結(jié)果表明APAP誘導(dǎo)的急性藥物性肝損傷會降低HNF-1的表達;在肝臟受損的情況下,C2-神經(jīng)酰胺可以下調(diào)HNF-1的表達,奧替普拉可以上調(diào)其表達。(5)GSTA1表達和含量的檢測結(jié)果表明,與對照組相比,模型組中GSTA1的m RNA和蛋白表達水平及含量均極顯著降低(p0.01),C2組和OL組均無顯著變化;與模型組相比,C2+AP組中GSTA1表達水平及含量均呈極顯著降低(p0.01)而OL+AP組極顯著升高(p0.01)。以上試驗結(jié)果與HNF-1表達試驗結(jié)果趨勢相一致。本研究成功復(fù)制小鼠急性藥物性肝損傷模型,發(fā)現(xiàn)肝臟受損時其GSTA1含量極顯著減少,表明藥物性肝損傷急性期GSTA1由肝臟釋放并參與機體抗氧化活動。確定C2-神經(jīng)酰胺和奧替普拉的給藥途徑和最適給藥濃度。在APAP誘導(dǎo)的急性藥物性肝損傷中,C2-神經(jīng)酰胺可使肝損傷程度加重,奧替普拉則會減輕肝損傷。在肝臟受損情況下,C2-神經(jīng)酰胺可下調(diào)HNF-1的表達,奧替普拉可上調(diào)HNF-1的表達。確定HNF-1可以調(diào)節(jié)GSTA1的表達,且m RNA表達水平與蛋白表達水平的趨勢相一致。HNF-1在體內(nèi)通過某種基因通路調(diào)控GSTA1表達來參與機體抗氧化活動,可以起到間接保護肝臟的作用,具體分子機制有待研究。
【關(guān)鍵詞】：HNF-1 GSTA1 藥物性肝損傷 醋氨酚 小鼠
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 1 引言13-21
• 1.1 藥物性肝損傷13-15
• 1.1.1 APAP導(dǎo)致急性肝損傷機制13-14
• 1.1.2 APAP肝毒性影響因素14-15
• 1.1.3 APAP致小鼠急性肝損傷模型15
• 1.2 肝損傷指標15-17
• 1.2.1 血清轉(zhuǎn)氨酶15-16
• 1.2.2 超氧化物歧化酶16
• 1.2.3 丙二醛16
• 1.2.4 還原型谷胱甘肽16
• 1.2.5 谷胱甘肽過氧化物酶16-17
• 1.3 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶A1相關(guān)研究17-18
• 1.3.1 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶概述17
• 1.3.2 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶A1功能17
• 1.3.3 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶A1國內(nèi)外研究進展17-18
• 1.4 肝細胞核因子-1 研究進展18-19
• 1.4.1 肝細胞核因子概述18
• 1.4.2 肝細胞核因子-1 結(jié)構(gòu)與功能18-19
• 1.5 HNF-1 調(diào)節(jié)劑19
• 1.5.1 C2-神經(jīng)酰胺概述19
• 1.5.2 奧替普拉概述19
• 1.6 本研究目的與意義19-21
• 2 材料與方法21-32
• 2.1 材料21-24
• 2.1.1 實驗動物21
• 2.1.2 主要試劑21-22
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備22-23
• 2.1.4 主要溶液配制23-24
• 2.2 方法24-32
• 2.2.1 APAP誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型的復(fù)制24-27
• 2.2.2 C2-神經(jīng)酰胺與奧替普拉的給藥試驗27-28
• 2.2.3 C2-神經(jīng)酰胺與奧替普拉對模型小鼠肝臟功能的影響28-29
• 2.2.4 肝損傷模型中HNF-1 對GSTA1表達的調(diào)節(jié)分析29-31
• 2.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析31-32
• 3 結(jié)果與分析32-43
• 3.1 APAP誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型的復(fù)制32-33
• 3.1.1 血清轉(zhuǎn)氨酶活性32-33
• 3.1.2 肝組織各指標33
• 3.1.3 肝組織GSTA1含量33
• 3.2 C2-神經(jīng)酰胺與奧替普拉的給藥試驗33-36
• 3.2.1 給藥途徑33-34
• 3.2.2 最適濃度34-36
• 3.3 C2-神經(jīng)酰胺與奧替普拉對模型小鼠肝臟功能的影響36-38
• 3.3.1 血清轉(zhuǎn)氨酶活性36
• 3.3.2 肝組織各指標36-37
• 3.3.3 肝臟病理組織學(xué)分析37-38
• 3.4 肝損傷模型中HNF-1 對GSTA1表達的調(diào)節(jié)分析38-43
• 3.4.1 HNF-1 對GSTA1 mRNA表達的調(diào)節(jié)38-40
• 3.4.2 HNF-1 對GSTA1蛋白表達的調(diào)節(jié)40-42
• 3.4.3 ELISA法測定肝組織中GSTA1含量42-43
• 4 討論43-47
• 4.1 APAP誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型的復(fù)制43-44
• 4.2 C2-神經(jīng)酰胺與奧替普拉的給藥試驗44
• 4.2.1 給藥途徑確定44
• 4.2.2 最適濃度篩選44
• 4.3 C2-神經(jīng)酰胺與奧替普拉對模型小鼠肝臟功能的影響44-45
• 4.4 HNF-1 與GSTA1的表達分析45-47
• 4.4.1 HNF-1 的表達水平分析45
• 4.4.2 GSTA1的表達水平分析45-47
• 5 結(jié)論47-48
• 致謝48-49
• 參考文獻49-55
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文55

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本文編號：1052071