本文關鍵詞：目標區(qū)域捕獲聯(lián)合高通量測序在遺傳性耳聾中的應用研究

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【摘要】：聽力損失是導致言語交流障礙的常見致殘性疾病,然而病因尚未完全闡明。其中,遺傳性耳聾是聽力損失的常見類型,相關基因的鑒定工作,自1995年第1個非綜合征型耳聾基因POU3F4被克隆以來,已發(fā)現(xiàn)85個非綜合征型耳聾基因和60余個綜合征型耳聾基因(http://hereditaryhearingloss.org/)。然而,現(xiàn)有的耳聾基因檢測集中于常見基因的常見突變,診斷率僅為30%左右,更多的遺傳性耳聾無法明確病因,仍然存在很大的探索空間,有待于進一步研究。近些年來,基因組檢測技術飛速發(fā)展,新一代測序技術日新月異并得以廣泛的應用,其深度、精度的日益增強為遺傳性耳聾基因克隆提供了前所未有的契機。外顯子組測序具有通量高、速度快、價格低的顯著優(yōu)勢,尤其適用于分析像遺傳性耳聾這樣的以孟德爾遺傳規(guī)律傳遞的單基因疾病,為遺傳性耳聾基因的克隆提供了高效快捷的工具。本研究立足于國家基因庫聾病分庫豐富的遺傳性耳聾資源,將豐富的資源與高通量的技術相結合,取得了一些令人欣喜的研究成果,本研究包括如下兩部分：第一部分目標區(qū)域捕獲聯(lián)合高通量測序在遺傳性耳聾中的效能研究第一章目標區(qū)域捕獲測序在已知突變耳聾家系中的效能驗證目的初步建立目標區(qū)域捕獲聯(lián)合高通量測序技術的遺傳性耳聾基因檢測平臺,驗證該方法在遺傳性耳聾基因診斷中的效能。方法設計一組遺傳性耳聾基因捕獲芯片對目標序列進行捕獲,包括已知遺傳性耳聾基因及從動物實驗表明可能和遺傳性耳聾相關的核基因共307個+線粒體基因全序列,選取已知致病突變的83例樣本進行高通量測序及測序數(shù)據(jù)分析,找出致病突變。采用自身前后對照及雙盲法對高通量測序結果與前期Sanger測序結果進行比較。結果83例已知致病突變的陽性檢測樣本中,總檢出率為100%。其中81例樣本檢測結果與Sanger測序完全一致,包括GJB2, 12SrRNA, SLC26A4,POU3F4, OTOF, PJVK共6個基因47種致病突變,突變類型以錯義突變和小片段插入缺失(Insert and deletion, InDel)為主；2例常染色體隱性遺傳樣本多檢出一個變異,明確了致病原因。結論307個聾病相關基因目標區(qū)域捕獲聯(lián)合高通量測序是遺傳性耳聾的有效診斷方法,將有效地推進遺傳性耳聾基因診斷的研究進展。第二章目標區(qū)域捕獲測序在未知病因耳聾家系中的應用本部分研究選取25例課題組前期經(jīng)Sanger測序排除常見基因突變的耳聾家系樣本,應用第一章研究內(nèi)容設計的芯片進行目標區(qū)域捕獲和高通量測序。其中5例檢測結果為陰性,未發(fā)現(xiàn)陽性變異；7例臨床信息完善的ADNSHL大家系中,鑒定了KCNQ4、TJP2、MYH14、MY07A等候選基因,另有兩大家系檢測結果為陰性；13例樣本的檢測結果為臨床意義未明,疑似致病。本部分研究在25個家系中的5個家系中鑒定了致病候選基因,檢出率為20%；13例檢出臨床意義未明變異的家系有待進一步家系內(nèi)及人群驗證,以明確致病性；7例陰性樣本將進行深入表型分析,并進一步選擇全外顯子組測序、全基因組測序或微陣列比較基因組雜交等方法繼續(xù)探索致病原因。第二部分常染色體顯性遺傳家系致病基因的鑒定第一章常染色體顯性遺傳性聽力損失家系鑒定KCNQ4新突變及已知突變本研究收集到一個5代84人的常染色體顯性遺傳大家系727及一個6代66人的常染色體顯性遺傳大家系025,兩家系的患者均表現(xiàn)為雙側對稱的、進行性下降的遲發(fā)型聽力損失,聽力損失表型和DFNA2型聽力損失一致。我們應用目標區(qū)域捕獲聯(lián)合高通量測序的方法對兩個家系中的先證者進行測序分析,經(jīng)過功能變異鑒定和頻率篩選后發(fā)現(xiàn)候選變異。應用PCR和Sanger測序?qū)蚁党蓡T進行候選變異的篩查,發(fā)現(xiàn)位于DFNA2基因座的KCNQ4基因的p.G285S突變在727家系患者均攜帶,而正常者均無此突變,表型和基因型共分離,p.W275R突變在025家系中共分離,這兩個突變均位于保守區(qū)域,可能影響基因編碼蛋白結構。其中p.G285S是已知致病突變,p.W275R突變是新突變。KCNQ4基因是電壓門控式鉀離子通道家族中的成員,在內(nèi)耳鉀離子循環(huán)中有重要作用。KCNQ4由6個跨膜區(qū)域組成(S1-S6),p.G285S與p.W275R均位于KCNQ4基因的第5和第6跨膜區(qū)之間,該區(qū)域是已經(jīng)報道DFNA2型聽力損失較集中的區(qū)域。本研究應用目標區(qū)域捕獲聯(lián)合高通量測序的策略在2個中國常染色體顯性遺傳的大家系中鑒定了KCNQ4基因的2個致病突變,為首次在中國人中發(fā)現(xiàn)的KCNQ4突變,并對該基因突變的基因型-表型進行了關聯(lián)分析,為后續(xù)闡明KCNQ4致聽力損失的分子機理及對遲發(fā)型聽力損失的防治提供了資源。第二章TJP2基因新突變和GJB2基因復合雜合突變在一個中國常染色體顯性遺傳家系的鑒定本部分研究內(nèi)容運用了經(jīng)典的連鎖分析及候選基因法,基因型-表型關聯(lián)分析,候選基因篩查及目標區(qū)域捕獲測序等多種方法,最終在686家系中鑒定一個常染色體顯性遺傳的聽力損失相關基因TJP2,并明確了家系中不共分離患者的基因型為GJB2復合雜合變異。為揭示中國常染色體顯性非綜合征性遺傳家系686的遺傳密碼,近10年來,我們課題組對該家系進行了連鎖分析,模塊化預測,基因型-表型關聯(lián)分析,候選基因篩查等方法。最終通過基因型表型關聯(lián)分析我們確定了可能致病的錯義突變TJP2(p.G694E),該基因與凋亡和年齡相關性聽力損失(age-related hearing loss, ARHL)密切相關,然而該突變在家系成員中不完全共分離。通過目標區(qū)域捕獲測序,方面我們進一步驗證了TJP2基因c.2081GA,并在不共分離患者中鑒定了GJB2基因復合雜合突變(p.Y136*和p.G45E),該成員與家系中其他患者表型不一致。綜之,我們在686家系中確定了同現(xiàn)的兩種遺傳原因,即TJP2致病突變及GJB2致病突變在家系中同時存在。TJP2可能致病的錯義突變同時也提供了進一步調(diào)查研究ARHL的機會。此外,通過對686家系近10年的研究,我們得出的結論是沒有一種技術足以解決所有ADNSHL的發(fā)病機制相關研究,因此,有必要將不同方法有效組合。
【關鍵詞】：遺傳性耳聾 常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾 目標區(qū)域捕獲 突變 高通量測序
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R764.43
【目錄】：

• 英文縮略詞表7-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-18
• 第一部分 目標區(qū)域捕聯(lián)合高通量測序在遺傳性耳聾中的效能研究18-54
• 引言18-19
• 第一章 目標區(qū)域捕獲測序在已知突變耳聾家系中的效能驗證19-34
• 材料與方法19-29
• 結果29-31
• 討論31-34
• 第二章 目標區(qū)域捕獲測序在未知病因耳聾家系中的應用34-54
• 材料與方法34
• 結果34-51
• 討論51-54
• 第二部分 常染色體顯性遺傳性聽力損失家系致病基因鑒定54-102
• 第一章 中國常染色體顯性遺傳性聽力損失家系KCNQ4致病突變的鑒定54-80
• 引言54
• 材料與方法54-58
• 結果58-76
• 討論76-80
• 第二章 TJP2基因新突變和GJB2基因復合雜合突變在一個中國常染色體顯性遺傳家系的鑒定80-102
• 引言80-81
• 材料與方法81-86
• 結果86-97
• 討論97-102
• 參考文獻102-110
• 文獻綜述目標區(qū)域捕獲聯(lián)合新一代測序技術在遺傳性聾研究中的應用及發(fā)展前景110-127
• 參考文獻122-127
• 附錄1127-130
• 附錄2130-135
• 個人簡歷135-138
• 致謝138-139

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 袁永一;黃德亮;戴樸;朱慶文;劉新;王國建;李琦;吳柏林;;中國非綜合征遺傳性聾人群GJB6基因突變分析[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2007年01期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 趙亞麗;前庭水管擴大與SLC26A4基因分子流行病學研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2006年

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本文編號：720237