本文選題：激肽釋放酶結(jié)合蛋白 + 人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞�。� 參考：《蘇州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥,是世界性的重要致盲性眼病,它的非增殖期表現(xiàn)包括微血管瘤、視網(wǎng)膜內(nèi)出血、視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常,增殖期表現(xiàn)為新生血管形成、玻璃體積血或視網(wǎng)膜前出血。眼內(nèi)新生血管生成是增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(Proliferative diabeticretinopathy,PDR)惡化和視力喪失的主要原因。新生血管導(dǎo)致的出血、滲出和增生牽引導(dǎo)致眼內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能破壞,終至視力喪失。所以,尋找有效的方法來防止和治療DR迫在眉睫。內(nèi)源性血管生成抑制因子激肽釋放酶結(jié)合蛋白(Kallistatin,Kallikrein-Binding Protein,KBP)是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族中的一員,有多種生物功能,包括調(diào)節(jié)血壓、抗炎、血管松弛和刺激內(nèi)膜增生等。研究發(fā)現(xiàn)KBP是一種血管生成抑制劑,能夠抑制腫瘤組織的新生血管反應(yīng),也可抑制大鼠后肢缺血模型的自發(fā)性血管生成,但是KBP對于人眼部視網(wǎng)膜新生血管的作用研究不多。本研究在人眼部組織標(biāo)本實(shí)驗(yàn)及離體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中探討了KBP與糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管形成的關(guān)系。第一部分KBP在增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體中表達(dá)水平的研究目的探討KBP是否參與糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管的形成。方法臨床因特發(fā)性黃斑裂孔、特發(fā)性黃斑前膜和PDR需行玻璃體切割手術(shù)的患者,糖尿病患者根據(jù)1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為2型糖尿病。分為2組:無糖尿病病史的特發(fā)性黃斑裂孔、特發(fā)性黃斑前膜患者作為對照組;因PDR手術(shù)的患者,為PDR組。25G玻璃體切割手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)三通道切口完成后,將1ml注射器接玻切頭的抽吸通道側(cè),玻切頭進(jìn)入前部玻璃體腔,未開灌注前,高速切割并抽吸玻璃體保存。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測玻璃體中KBP的表達(dá)。結(jié)果ELISA檢測結(jié)果顯示對照組玻璃體KBP含量為38.48±1.97μg/ml,PDR組玻璃體KBP含量為18.35±2.74μg/ml,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.59,P0.05)。結(jié)論糖尿病視網(wǎng)膜病變PDR期患者玻璃體中KBP表達(dá)下降,可能與PDR的形成相關(guān),KBP可能對糖尿病視網(wǎng)膜新生血管的形成有抑制作用。第二部分KBP抑制高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的研究目的觀察KBP對高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖是否有抑制作用。方法1.將人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human retinal endothelial cells,HRECs)分成兩組,分別加入5m M和30m M濃度糖溶液干預(yù)24h后提取細(xì)胞RNA,檢測不同糖濃度對KBP及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。2.將細(xì)胞分成4組:加5m M濃度葡萄糖,加30m M濃度葡萄糖,加30m M濃度葡萄糖及100n M KBP或1000n M KBP。將細(xì)胞加入96孔板中,每孔約1000細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁,饑餓處理24h,加入不同濃度葡萄糖及KBP干預(yù)24h,再加入CCK-8 10μl,37℃培養(yǎng)箱放置2-4h,酶聯(lián)儀檢測每孔內(nèi)450nm波長的吸光度(OD值),記錄分析。收集細(xì)胞,進(jìn)行western blot檢測VEGF的蛋白表達(dá)。3.將細(xì)胞分成3組:加5m M濃度葡萄糖,加30m M濃度葡萄糖,加30m M濃度葡萄糖及1000n M KBP。細(xì)胞遷移用24孔板,Transwell小室裝置,細(xì)胞饑餓過夜加入膜上層,下層加入不同濃度葡萄糖和KBP,24h后,記錄膜下層的細(xì)胞數(shù)。4.將細(xì)胞分成3組:加5m M濃度葡萄糖,加30m M濃度葡萄糖,加30m M濃度葡萄糖及1000n M KBP。將HRECs以及不同濃度的葡萄糖及KBP加入到含Matrigel基質(zhì)膠的96孔板內(nèi),培養(yǎng)箱培養(yǎng)8h后拍照,管腔數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析。5.將細(xì)胞分成兩組:一組導(dǎo)入干擾KBP基因表達(dá)的si RNA,一組導(dǎo)入空載si RNA。在5m M葡萄糖環(huán)境下進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、管腔形成實(shí)驗(yàn)。分別記錄結(jié)果統(tǒng)計(jì)。結(jié)果1.RT-PCR結(jié)果顯示,與5m M糖濃度相比,30m M糖濃度刺激HRECs中KBP及VEGF的表達(dá)(P0.05)。2.與5m M糖濃度相比,30m M糖濃度促進(jìn)細(xì)胞的增殖遷移及管腔形成,加入了100n M KBP或1000n M KBP后,這些作用被抑制(P0.05)。3.VEGF的蛋白表達(dá)在30m M葡萄糖+1000nmol/L KBP組低于30m M葡萄糖組。4.在5m M糖濃度環(huán)境下,用KBP si RNA干擾KBP基因表達(dá)可以提高細(xì)胞增殖遷移管腔形成的能力(P0.05)。5.在5m M糖濃度環(huán)境下,用KBP si RNA干擾細(xì)胞KBP基因,VEGF蛋白表達(dá)增加。結(jié)論1.高糖促進(jìn)HRECs KBP及VEGF基因表達(dá)。2.100n M KBP或1000n M KBP抑制高糖刺激誘導(dǎo)的HRECs增殖。3.1000n M KBP抑制高糖刺激誘導(dǎo)的HRECs中VEGF的表達(dá)。4.抑制KBP基因表達(dá)可以提高HRECs的增殖作用。5.抑制KBP基因提高HRECs中VEGF的表達(dá)。
[Abstract]:Diabetic retinopathy (DR) is a common microvascular complication of diabetes. It is an important blind eye disease in the world. Its non proliferative stages include microangioma, intraretinal hemorrhage, and microvascular abnormalities in the retina. The proliferative stage is neovascularization, vitreous blood or retinal hemorrhage. Angiogenesis is the main cause of Proliferative diabeticretinopathy (PDR) deterioration and loss of vision in proliferative diabetic retinopathy. Hemorrhage, exudation and hyperplastic traction caused by neovascularization lead to structural and functional damage to the eye, and end to visual loss. Therefore, the search for effective methods to prevent and treat DR is imminent. Kallistatin (Kallikrein-Binding Protein, KBP), a member of the serine protease inhibitor family, is a member of the serine protease inhibitor family. It has a variety of biological functions, including regulating blood pressure, anti-inflammatory, vascular relaxation, and stimulating intima hyperplasia. The development of KBP is a angiogenesis inhibitor that inhibits tumor tissue. The neonatal vascular response can also inhibit spontaneous angiogenesis in the rat hind limb ischemia model, but the effect of KBP on human retinal neovascularization is not much studied. In this study, the relationship between KBP and the formation of neovascularization in diabetic retinopathy was investigated in human ocular tissue specimens and in vitro culture experiments. The first part K Study of the expression level of BP in the vitreous body of patients with proliferative diabetic retinopathy to investigate whether KBP participates in the formation of neovascularization of diabetic retinopathy. Methods patients with idiopathic macular holes, idiopathic macular macular membrane and PDR need vitrectomy, and diabetic patients are determined according to the 1999 WHO diagnostic criteria. Type 2 diabetes mellitus. It was divided into 2 groups: the idiopathic macular hole without the history of diabetes, the patients with idiopathic macular membrane as the control group; the 1ml syringe received the vitreous head of the 1ml syringe after the three channel incision of the.25G vitrectomy, and the vitreous head entered the anterior vitreous cavity after the operation of the.25G vitrectomy. The expression of KBP in vitreous body was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results the results of ELISA detection showed that the KBP content in the vitreous body of the control group was 38.48 + 1.97 mu g/ml and the KBP content in the vitreous body of PDR group was 18.35 + 2.74 mu g/ml, and the two groups were statistically significant (t=16.59, P0.05). Conclusion diabetes mellitus (t=16.59, P0.05). Conclusion diabetes mellitus. The decrease of KBP expression in vitreous body of patients with retinopathy PDR may be related to the formation of PDR. KBP may inhibit the formation of retinal neovascularization in diabetic retina. Second part KBP inhibits the proliferation of human retinal capillary endothelial cells induced by high glucose, and the aim of KBP to the human retinal capillary blood induced by high glucose Methods 1. Human retinal endothelial cells (HRECs) of human retinal capillary endothelial cells (HRECs) was divided into two groups, and 5m M and 30m M concentration solution were added to 24h to extract cell RNA, and the effects of different sugar concentrations on the expression of KBP and vascular endothelial growth factor were detected. 4 groups: 5m M concentration glucose, 30m M concentration glucose, 30m M concentration glucose and 100N M KBP or 1000N M KBP., cells were added to 96 Kong Banzhong, about 1000 cells per pore. 50nm wavelength absorbance (OD), recording analysis, collecting cells, Western blot detection of VEGF protein expression.3. into 3 groups: 5m M concentration of glucose, 30m M concentration of glucose, 30m M concentration glucose and 1000N cells migrating 24 orifice, cell starvation overnight into the upper layer, the lower layer added After different concentrations of glucose and KBP, 24h, the number of cells recorded in the lower layer of the membrane was divided into 3 groups: 5m M concentration glucose, 30m M concentration of glucose, 30m M concentration glucose and 1000N M KBP., and different concentrations of glucose and added into the 96 pore plate containing the matrix glue, culture box culture and the number of photographs Statistical analysis.5. divided the cells into two groups: one group introduced Si RNA that interfered with the expression of KBP gene, and a group of Si RNA. was introduced into the 5m M glucose environment for CCK-8 experiment, cell migration experiment, and lumen formation experiment. The results were recorded. Results 1.RT-PCR results showed that the concentration of saccharide concentration was compared with 5m M sugar concentration. Compared with the concentration of 5m M, the concentration of 30m M sugar promoted the proliferation and migration of the cells and the formation of the lumen. After adding 100N M KBP or 1000N M KBP, these effects were inhibited by the 100N M KBP or 1000N M KBP. The expression can improve the ability of cell proliferation and migration (P0.05).5. in 5m M glucose concentration environment, KBP Si RNA interferes with cell KBP gene and VEGF protein expression increases. Conclusion 1. high sugar promotes HRECs KBP and VEGF genes to inhibit high sugar stimulation induced proliferation inhibition of high glucose stimulation The expression of VEGF in induced HRECs,.4. inhibited KBP gene expression and increased the proliferation of HRECs..5. inhibited KBP gene and increased VEGF expression in HRECs.
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R774.1;R587.2

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本文編號：2007352