肌腱干細胞(TSPC)是肌腱組織工程與再生中的潛在種子細胞,但體外培養(yǎng)過程中TSPCs極易丟失表型�；谛》肿铀幬镆子诤铣�、保存和質(zhì)量控制的優(yōu)勢,本研究探索利用高通量篩選獲得用于TSPCs體外擴增和表型維持的小分子化合物,建立穩(wěn)定培養(yǎng)體系。我們利用Scx GFP熒光可視化報告系統(tǒng)對FDA批準的小分子庫和生物活性庫中的小分子進行高通量篩選,獲得TSPCs表型維持的候選分子群,復篩進一步驗證陽性小分子。我們優(yōu)化每個分子的濃度,得到維持表型并啟動腱系分化的最佳小分子組合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小分子組合在維持表型的同時不能促進細胞增殖。因此,本課題進一步通過高內(nèi)涵細胞分析篩選得到促進細胞增殖的小分子。之后我們用單細胞分析手段進行分化確認,并通過比較實驗獲得腱系分化誘導的最佳小分子組合。基于以上發(fā)現(xiàn),我們建立了TSPCs分階段培養(yǎng)誘導策略,第一步利用小分子先促進細胞增殖,第二步利用小分子組合進行腱系分化誘導,并進一步結(jié)合生物相容性的水凝膠材料實現(xiàn)體內(nèi)的應用。我們通過3D打印技術將分階段誘導的活細胞與水凝膠結(jié)合在一起,在體內(nèi)促進肌腱再生與修復。綜上所述,本課題建立了分階段誘導TSPCs分化的小分子策略,并結(jié)合...

【文章頁數(shù)】：113 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
縮略詞
緒論
1 高通量篩選肌腱干細胞表型維持和體外擴增的小分子及組合
    1.1 引言
    1.2 實驗試劑與儀器
        1.2.1 材料和試劑
        1.2.2 實驗儀器
        1.2.3 試劑配制
    1.3 實驗方法
        1.3.1 TSPCs分離培養(yǎng)
        1.3.2 細胞復蘇
        1.3.3 細胞傳代
        1.3.4 細胞凍存
        1.3.5 DAPI染色
        1.3.6 高內(nèi)涵篩選
        1.3.7 細胞增殖檢測
        1.3.8 統(tǒng)計學分析
    1.4 實驗結(jié)果
        1.4.1 肌腱干細胞在體外培養(yǎng)過程中表型逐漸丟失
        1.4.2 初篩獲得六十種維持肌腱干細胞表型的小分子
        1.4.3 復篩獲得八種維持肌腱干細胞表型的小分子
        1.4.4 組合篩選獲得五種有效維持肌腱干細胞表型的小分子組合
        1.4.5 高通量篩選獲得六種促進肌腱干細胞體外擴增的小分子
    1.5 討論
2 高通量qPCR評估小分子及組合促進肌腱干細胞體外擴增和表型維持的效果
    2.1 引言
    2.2 實驗試劑與儀器
        2.2.1 材料和試劑
        2.2.2 實驗儀器
        2.2.3 試劑配制
    2.3 實驗方法
        2.3.1 cDNA制備
        2.3.2 引物設計
        2.3.3 BioMark上機
        2.3.4 其余方法同第一章
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 聚類分析顯示不同處理組間的基因差異
        2.4.2 主成分分析揭示四種細胞亞群
        2.4.3 分析各亞群特異表達的基因
        2.4.4 表型維持小分子及組合對關鍵腱系基因表達的影響
        2.4.5 促增殖小分子對關鍵基因表達的影響
    2.5 討論
3 建立肌腱干細胞表型維持及分階段腱系誘導策略
    3.1 引言
    3.2 實驗試劑與儀器
        3.2.1 材料和試劑
        3.2.2 實驗儀器
        3.2.3 試劑配制
    3.3 實驗方法
        3.3.1 試劑盒提取RNA
        3.3.2 實時熒光定量PCR
        3.3.3 細胞免疫熒光
        3.3.4 組織工程肌腱構(gòu)建
        3.3.5 HE染色
        3.3.6 Masson染色
        3.3.7 天狼星紅染色
        3.3.8 三系分化誘導
        3.3.9 ALP染色
        3.3.10 SO染色
        3.3.11 其余方法同第一、二章
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 五種小分子組合的效果比較
        3.4.2 確立促進腱系分化的最佳小分子組合C1
        3.4.3 小分子組合C1的效果驗證
        3.4.4 建立小分子分階段腱系誘導體系
    3.5 討論
4 小分子分階段腱系誘導策略結(jié)合水凝膠體系修復肌腱損傷
    4.1 引言
    4.2 實驗試劑與儀器
        4.2.1 材料和試劑
        4.2.2 實驗儀器
        4.2.3 試劑配制
        4.2.4 實驗動物
    4.3 實驗方法
        4.3.1 浸提液檢測膠體毒性
        4.3.2 掃描電鏡
        4.3.3 細胞骨架染色
        4.3.4 死活細胞染色
        4.3.5 皮下埋入動物模型的建立
        4.3.6 髕腱缺損動物模型的建立
        4.3.7 細胞追蹤CM-Dil染色
        4.3.8 膠體制備及3D打印
        4.3.9 組織學檢測
        4.3.10 組織免疫熒光
        4.3.11 Trizol法提取RNA
        4.3.12 透射電鏡
        4.3.13 膠原纖維直徑測量
        4.3.14 力學測試
        4.3.15 其余方法同第一、二、三章
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 Gel MA和 HA-NB復合水凝膠材料表征
        4.4.2 異位肌腱再生兩周后的效果評估
        4.4.3 異位肌腱再生四周后的效果評估
        4.4.4 原位肌腱修復兩周后的效果評估
        4.4.5 原位肌腱修復四周后的效果評估
    4.5 討論
5 總結(jié)
參考文獻
綜述 生物活性分子調(diào)控干細胞命運用于肌腱再生
    參考文獻
作者簡歷及在學期間所取得的科研成果



本文編號：3751893