發(fā)布時間：2017-07-28 14:27

  本文關鍵詞：ADSCs復合PRF修復家兔耳軟骨缺損的實驗研究

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【摘要】：【背景】 根據(jù)國家疾控中心的不完全統(tǒng)計，因疾病和外傷導致的軟骨缺損發(fā)生率約為1.5%-3%，隨著運動意識的提高，以及交通等意外事故的增加，其發(fā)生率逐年遞增。雖然目前也有許多治療軟骨缺損的方法，如自體軟骨移植、異體軟骨移植以及人工合成生物材料等，但總是不太理想，要么取材不便，要么不易操作，并且花費太大。組織工程為軟骨損傷修復提供了新的選擇，操作方便、安全有效、經(jīng)濟實惠的軟骨缺損修復方法正在被廣泛研究與探索。本課題就是以方便、安全、有效、經(jīng)濟為宗旨，嘗試將未誘導的自體或異體ADSCs與PRF復合作為一種軟骨修復材料，研究其對家兔耳軟骨全層缺損的修復作用，為以后組織工程軟骨的進一步研究打下基礎。 【目的】 將未誘導的自體或異體脂肪干細胞（ADSCs）與富血小板纖維蛋白（PRF）復合，作為一種全新的軟骨修復材料，探討其對家兔耳軟骨全層缺損修復的可行性，并檢測其免疫排斥反應。 【方法】 1、采用組織分離培養(yǎng)法從家兔背部脂肪中獲取ADSCs進行培養(yǎng)，將獲得的細胞進行HE染色、成脂肪及成骨誘導培養(yǎng)，并使用FCM對干細胞分子表型進行鑒定，最后將目標細胞進行大量的體外培養(yǎng)，供移植使用。 2、制備家兔PRF，并與培養(yǎng)的ADSCs復合作為一種軟骨缺損修復材料備用。 3、建立軟骨缺損動物模型。在家兔耳廓做出一個軟骨全層缺損的創(chuàng)傷，使用ADSCs與PRF復合物移植修復，通過大體觀察與組織學觀察（HE和阿爾新蘭染色）的方法觀察軟骨缺損的修復情況。 4、實驗分組。取家兔30只，于每只家兔耳部做4處軟骨全層缺損，隨機分為6組，A組，作為空白對照；B組植入自體ADSCs；C組植入異體ADSCs；D組植入自體PRF；E組植入自體ADSCs與PRF的復合物；F組植入異體ADSCs與PRF的復合物。分別于術后1月、2月、3月取材，進行大體、HE染色及阿爾新蘭染色觀察，并使用IPP6.0軟件對軟骨生成量進行半定量分析。 5、免疫學檢測。分別取實驗前和實驗后1w、2w、4w、3月的家兔全血和血漿，流式細胞儀進行外周血淋巴細胞CD4和CD8亞群的檢測，ELISA法測定血漿中IL-2和IL-4的水平。 6、統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)使用SPSS16.0軟件統(tǒng)計分析處理，計量資料以均數(shù)±標準差（X±SD）形式表示，多個樣本均數(shù)比較用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α值取雙側0.05. 【結果】 1、該實驗分離獲取培養(yǎng)的ADSCs形態(tài)呈現(xiàn)為長梭形，自我更新和增殖能力強，表達脂肪干細胞特異性的表面抗原CD29，其陽性表達率為（91.2±2.9）%，而CD31陰性表達，表達率為（2.9±1.5）%，且可向成脂和成骨的方向分化，其生物學特性穩(wěn)定。 2、制備的PRF形態(tài)良好，質(zhì)地韌，，有彈性，易于進行移植實驗。 3、動物模型成功建立。大體觀察，HE和阿爾新蘭染色均顯示，模型建立3個月后軟骨缺損區(qū)無新生軟骨形成，表明軟骨缺損動物模型成功建立。 4、移植后效果觀察結果。大體及組織學觀察顯示，3月后，A組無新生軟骨生成，軟骨缺損無修復跡象；B組和C組在缺損區(qū)邊緣均可見到少量的新生軟骨組織，但缺損區(qū)仍很明顯，與空白對照組相似；D組，大體觀察見缺損區(qū)有一層膜狀物形成，組織學觀察見新生軟骨組織較多，對缺損有一定的修復作用；E組和F組，可見缺損區(qū)被新生軟骨組織覆蓋，表面光滑，與周圍軟骨組織融合一致，修復效果最佳。IPP6.0統(tǒng)計結果顯示，移植物植入3月后，A組軟骨缺損修復率為（1.68±0.17）%， B組為（15.9±0.87）%、C組為（15.4±0.91.）%，D組為（32.0±2.76）%，E組為（87.59±3.21）%、F組為（85.77±4.88）%。SPSS16.0統(tǒng)計分析結果，B組與C組之間（P0.05）、E組與F組之間（P0.05），組間無統(tǒng)計學差異，可以認為自體ADSCs組與異體ADSCs組兩組之間的修復效果無差異，自體ADSCs復合PRF組與異體ADSCs復合PRF組兩組之間的修復效果無差異；空白對照組、ADSCs組、PRF組、ADSCs復合PRF組，各組間（P0.01）,均有統(tǒng)計學差異，表明四組間修復效果均存在顯著性差異。 5、免疫學檢測結果顯示，異體ADSCs參與的組織修復實驗中，實驗動物在修復材料植入前與植入后測得的淋巴細胞CD4和CD8亞群、CD4/CD8比值和IL-2、IL-4的值，在不同時間點所測值的變化無統(tǒng)計學差異（P0.05）；HE染色結果同樣顯示：異體ADSCs植入?yún)^(qū)的組織中并無淋巴細胞浸潤，均表明異體ADSCs的植入沒有引起明顯的免疫排斥反應。 【結論】 1.該實驗培養(yǎng)獲取的細胞確為ADSCs，具有自我增殖能力，并有多向分化潛能，可以作為組織工程的種子細胞來源。 2.該實驗動物模型易于操作，便于觀察，是一種理想的軟骨缺損實驗動物模型。 3.自體或異體ADSCs復合PRF均能夠有效的修復家兔耳軟骨全層缺損，且二者的修復效果沒有差異。 4.異體ADSCs移植不會引起明顯的免疫排斥反應。
【關鍵詞】：異體脂肪干細胞 富血小板纖維蛋白 軟骨缺損修復 免疫排斥
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R783.1
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-13
• 文獻回顧13-20
• 實驗一 ADSCs 的體外分離、培養(yǎng)及鑒定20-27
• 1 材料20-21
• 2 方法21-24
• 3 結果24-25
• 4 討論25-27
• 實驗二 ADSCs 復合 PRF 在家兔耳軟骨區(qū)生長分化的實驗觀察27-32
• 1 材料27
• 2 方法27-29
• 3 結果29
• 4 討論29-32
• 實驗三 ADSCs 復合 PRF 修復家兔耳軟骨缺損的實驗研究32-46
• 1 材料32
• 2 方法32-35
• 3 結果35-42
• 4 討論42-46
• 全文總結46-47
• 參考文獻47-56
• 附錄56-64
• 個人簡歷和研究成果64-65
• 致謝65

【參考文獻】

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本文編號：584516