本文關(guān)鍵詞：REDV修飾對脫細(xì)胞帶瓣靜脈支架體外再內(nèi)皮化的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的： 構(gòu)建并移植組織工程化的帶瓣靜脈，被認(rèn)為是治療深靜脈瓣膜功能不全的理想方案。前期的工作中，本實驗室成功地在體外靜態(tài)條件下構(gòu)建了與天然靜脈瓣結(jié)構(gòu)相似的組織工程化靜脈瓣，體內(nèi)移植后可在6個月內(nèi)行使正常生理功能，但，術(shù)后6個月以后，瓣膜表面逐漸出現(xiàn)ECs成簇生長、脫落、血栓形成、管腔閉塞而喪失瓣膜的功能。我們初步認(rèn)為，這種情況的出現(xiàn)，可能與內(nèi)皮化不完全、ECs與支架材料的黏附力不足、脫細(xì)胞過程對支架材料的損傷及變性等因素有關(guān)。本課題的目的，是通過加強(qiáng)ECs與支架材料的黏附，探討提高組織工程化帶瓣靜脈內(nèi)皮化程度的方法。 應(yīng)用多肽——尤其是特異性多肽修飾支架材料表面，作為一種新的促進(jìn)內(nèi)皮化的研究策略，越來越得到重視。REDV就是一種能選擇性促進(jìn)ECs/EPCs黏附和擴(kuò)展的特異性多肽。 本實驗擬在制備脫細(xì)胞帶瓣靜脈支架的基礎(chǔ)上，摸索并優(yōu)化PEG橋接KREDVY共價結(jié)合修飾脫細(xì)胞帶瓣靜脈支架材料所需各反應(yīng)步驟的實驗條件，并研究REDV修飾對脫細(xì)胞帶瓣靜脈支架體外再內(nèi)皮化的影響。 研究方法： （1）脫細(xì)胞帶瓣靜脈支架材料的制備：通過H-E染色及透射電鏡觀察等方法，比較Triton-X100、0.05%胰蛋白酶、和0.25%胰蛋白酶等三種脫細(xì)胞方法的效果，選擇相對更為合適的方法，制備脫細(xì)胞帶瓣靜脈支架材料。 （2）支架材料巰基化：將脫細(xì)胞支架材料浸入分別按1:50、1:25、1:12.5、1:6.25和1:3.125等，五種不同濃度稀釋的巰基化試劑SATA溶液中，在反應(yīng)30min、1h、2h和4h等四個時間點，分別采用DTNB法檢測支架材料所交聯(lián)自由巰基的含量，進(jìn)而確定SATA最佳的作用濃度和作用時間。 （3）支架PEG化：將巰基化支架材料與過量投入的Mal-PEG-NHS混合反應(yīng)，在室溫反應(yīng)2h、4h、6h和12h等四個不同時間點，檢測支架殘余自由巰基的含量，進(jìn)而確定共價結(jié)合Mal-PEG-NHS最佳的反應(yīng)時間。 （4）共價結(jié)合KREDVY：HPLC監(jiān)測Mal-PEG-NHS與KREDVY的反應(yīng)效率，選擇合適的反應(yīng)條件。親和免疫化學(xué)染色示蹤Biotin，表征能否通過以上反應(yīng)步驟將K(Biotin)REDVY共價結(jié)合至支架材料上。 （5）腔內(nèi)順向注射1×107/ml的EPCs單細(xì)胞懸液后培養(yǎng)7d，再逆向注射EPCs單細(xì)胞懸液后培養(yǎng)7d，兩端放開后再培養(yǎng)7d，實現(xiàn)修飾后支架的體外再內(nèi)皮化。H-E染色、掃描電鏡觀察瓣膜表面細(xì)胞生長的情況，免疫組織化學(xué)檢測細(xì)胞表面VEGF的表達(dá)。PEG橋接KREDVY修飾支架為實驗組，單純PEG修飾和未修飾脫細(xì)胞支架作為對照組。 （6）利用BOSE ElectroForce5100生物反應(yīng)器搭建體外灌流環(huán)路，給予各組再內(nèi)皮化后支架30min的恒流量1%β-葡聚糖溶液灌流，流量控制為50ml/min，掃描電鏡觀察瓣膜表面殘留的細(xì)胞。 結(jié)果： （1）經(jīng)0.05%胰蛋白酶組脫細(xì)胞方法處理后，支架材料中細(xì)胞成分祛除較為干凈，膠原纖維排列相對更加整齊，且纖維間隙相對適中。 （2）支架巰基化的效果，主要取決于SATA的濃度，而與作用時間的關(guān)系不明顯；當(dāng)SATA的濃度提高至按1:12.5稀釋時，支架交聯(lián)的巰基量趨于飽和，穩(wěn)定于0.05mmol/L水平。 （3）隨著與Mal-PEG-NHS的反應(yīng)時間延長，支架上殘余的自由巰基含量持續(xù)下降，其中以室溫反應(yīng)12h組巰基量下降最多，由0.043mmol/L水平下降至小于0.01mmol/L水平。 （4）溶劑為5%DMSO+95%PBS，室溫反應(yīng)12h的條件下，Mal-PEG-NHS與KREDVY的反應(yīng)效率最高。 （5）親和組織化學(xué)染色結(jié)果顯示共價結(jié)合K(Biotin)REDVY組可見內(nèi)膜面有棕黃色較深染色的區(qū)域，證明KREDVY已固定于脫細(xì)胞帶瓣靜脈支架表面。 （6）體外再內(nèi)皮化后，PEG橋接KREDVY修飾組支架上細(xì)胞密度高，分布更均勻，免疫組織化學(xué)顯示細(xì)胞表達(dá)VEGF。 （7）按牛頓流體切應(yīng)力計算公式推算，體外灌流時，支架材料內(nèi)膜面所受切應(yīng)力約為2dyne/cm2，近似于生理條件下人體靜脈血管壁所受的切應(yīng)力。灌流后各組細(xì)胞均有一定程度脫落，但PEG橋接KREDVY修飾組支架上有更多細(xì)胞殘留。結(jié)論： （1）0.05%胰蛋白酶組脫細(xì)胞方法的脫細(xì)胞效果最好。 （2）本實驗所采用的先巰基化，再共價結(jié)合PEG，最后共價結(jié)合KREDVY的順行修飾方法，簡單、可行，能將KREDVY共價結(jié)合至脫細(xì)胞帶瓣靜脈支架上。 （3）REDV修飾能促進(jìn)支架材料更好地體外內(nèi)皮化。 （4）REDV修飾能一定程度地提高細(xì)胞抵抗血管壁切應(yīng)力的能力。
【關(guān)鍵詞】：REDV 表面修飾 脫細(xì)胞支架 靜脈瓣 內(nèi)皮化
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-14
• 英文縮寫表14-15
• 緒言15-20
• 參考文獻(xiàn)17-20
• 第一部分 PEG 橋接 REDV 短肽修飾脫細(xì)胞帶瓣靜脈支架及其優(yōu)化20-37
• 一 前言20-21
• 二 試劑和儀器設(shè)備21-23
• （一） 試劑21
• （二） 儀器設(shè)備21-22
• （三） 主要試劑的配制22-23
• 三 方法23-27
• （一） 脫細(xì)胞帶瓣靜脈支架的制備23-25
• 1. 綿羊帶瓣股靜脈的取材及修剪23
• 2. 脫細(xì)胞綿羊帶瓣靜脈的制備23-24
• 3. 脫細(xì)胞帶瓣靜脈支架的鑒定24-25
• （二） 支架材料的修飾及其優(yōu)化25-27
• 1. 半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)濃度 OD 值曲線的建立25
• 2. 脫細(xì)胞支架的巰基化25-26
• 3. 巰基化支架與 Mal-PEG-NHS 的共價結(jié)合26
• 4. PEG 化脫細(xì)胞支架與 KREDVY 的共價結(jié)合26-27
• 5. KREDVY 修飾后支架材料的鑒定27
• 四 統(tǒng)計學(xué)分析27-28
• 五 結(jié)果28-32
• （一） 脫細(xì)胞支架的形態(tài)結(jié)構(gòu)28-30
• 1. 大體觀察28
• 2. H-E 染色28-29
• 3. 透射電鏡29-30
• （二） 支架材料的修飾及其優(yōu)化30-32
• 1. 脫細(xì)胞支架的巰基化30
• 2. 巰基化支架與 Mal-PEG-NHS 的共價結(jié)合30-31
• 3. Mal-PEG-NHS 與 KREDVY 的反應(yīng)31-32
• 4. KREDVY 修飾后脫細(xì)胞支架的鑒定32
• 六 討論32-35
• 1. 脫細(xì)胞支架的制備32-33
• 2. 短肽修飾功能化支架材料的考量33
• 3. 支架功能化的方法33-34
• 4. PEG 橋接 REDV 共價結(jié)合支架材料的反應(yīng)條件和參數(shù)34-35
• 參考文獻(xiàn)35-37
• 第二部分 REDV短肽修飾對脫細(xì)胞帶瓣靜脈支架體外再內(nèi)皮化的影響37-50
• 一 前言37
• 二 試劑和儀器設(shè)備37-39
• （一） 試劑37-38
• （二） 儀器設(shè)備38-39
• （三） 主要試劑的配制39
• 三 方法39-44
• （一） 兔骨髓來源 EPCs 的分離、培養(yǎng)、鑒定39-41
• 1. 兔骨髓來源 EPCs 的原代培養(yǎng)39-40
• 2. 兔骨髓來源 EPCs 的傳代培養(yǎng)40
• 3. 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇40
• 4. 兔骨髓來源 EPCs 的鑒定40-41
• （二） KREDVY 修飾脫細(xì)胞支架的體外再內(nèi)皮化41-42
• 1. 制備 KREDVY 修飾的脫細(xì)胞支架41-42
• 2. 支架材料的體外再內(nèi)皮化42
• （三） 再內(nèi)皮化后支架的體外灌流試驗42-43
• （四） 內(nèi)皮化情況的評價43-44
• 1. H-E 染色43
• 2. 免疫組織化學(xué)43-44
• 3. 掃描電鏡44
• 四 結(jié)果44-48
• （一） EPCs 的形態(tài)學(xué)特性44-45
• （二） 支架材料體外再內(nèi)皮化后的形態(tài)學(xué)檢測45-47
• （三） 體外灌流試驗后的形態(tài)學(xué)檢測47-48
• 五 討論48-49
• 1. 體外內(nèi)皮化的方法48
• 2. REDV 修飾對脫細(xì)胞帶瓣靜脈支架材料再內(nèi)皮化的促進(jìn)作用48
• 3. REDV 修飾對 ECs 抵抗切應(yīng)力的保護(hù)作用48-49
• 參考文獻(xiàn)49-50
• 全文小結(jié)50
• 本課題的創(chuàng)新點50
• 本課題的意義50-51
• 綜述51-59
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 在讀期間發(fā)表文章、基金申請和獎勵59-60
• 致謝60-61

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張紅霞;翟萬銀;張紅鋒;;適用于不同尺寸血管的脫細(xì)胞方法研究(英文)[J];華東師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2012年04期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張永珍;組織工程化靜脈瓣構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：REDV修飾對脫細(xì)胞帶瓣靜脈支架體外再內(nèi)皮化的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：505790