本文關(guān)鍵詞：低強(qiáng)度脈沖超聲優(yōu)化組織工程化軟骨的構(gòu)建及其修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的： 隨著交通的日益發(fā)達(dá)與體育運(yùn)動(dòng)的不斷普及,關(guān)節(jié)軟骨損傷的發(fā)病率呈遞增趨勢(shì),加之人口老齡化產(chǎn)生的大量骨關(guān)節(jié)炎的患者,使得軟骨缺損修復(fù)一度成為臨床及相關(guān)基礎(chǔ)研究中亟待解決的難題之一,目前經(jīng)典的全層透明軟骨修復(fù)方法大部分不能達(dá)到預(yù)期的療效,因此,研究人員和醫(yī)生必須找出一個(gè)可靠的方法。近年來(lái),組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為人們帶來(lái)了新的希望。本研究選取藻酸鈣作為載體、軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞,在低強(qiáng)度脈沖超聲(Low-intensive Pulsed Ultrasound, LIPUS)的干預(yù)下構(gòu)建組織工程化軟骨,并探討其對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)作用,為治療軟骨缺損提供一個(gè)新思路。 方法： 1、選取2周齡的新西蘭大白兔,無(wú)菌操作下切取雙膝關(guān)節(jié)軟骨,采用機(jī)械法聯(lián)合酶一步消化法分離軟骨細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng),對(duì)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)鑒定(甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色)。 2、將軟骨細(xì)胞與海藻酸鈉混合制成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/ml,加入足量的Cacl2,混勻后放入特定的模型中制作成特定形狀的軟骨細(xì)胞／藻酸鈣凝膠復(fù)合物。 3、將制備好的凝膠分組施加LIPUS刺激,空白組(無(wú)超聲)；低強(qiáng)度超聲組(F0:1MHZ, PRF:1kHZ, Amp:50mv, Cycle:50);中強(qiáng)度超聲組(F0:1MHZ, PRF:1kHZ, Amp:75mv, Cycle:50);高強(qiáng)度超聲組(F0:1MHZ, PRF:1kHZ, Amp:100mv, Cycle:50),干預(yù)三天后通過(guò)CCK-8及免疫組化檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況、Ⅱ型膠原的表達(dá)量,從而篩選出最佳的超聲參數(shù)。 4、選取27只28～35周齡的新西蘭大白兔,采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ圃焱霉晒趋灵g窩直徑約為3mm,深3mm的圓柱形軟骨缺損模型,將兔子分為模型組(Control)、普通藻酸鈣組(LIPUS-)及超聲藻酸鈣組(LIPUS+)。在藻酸鈣組及超聲藻酸鈣組中分別填入對(duì)應(yīng)的凝膠,分別于4、8、12周處死兔子,切取股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行大體觀察及病理學(xué)觀察,對(duì)組織切片進(jìn)行HE染色、番紅O染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色,并進(jìn)行wakitani評(píng)分。 結(jié)果： 1、通過(guò)機(jī)械法聯(lián)合酶消化法可順利的分離出軟骨細(xì)胞,一定的培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)至2-3代的細(xì)胞生長(zhǎng)能力強(qiáng)、細(xì)胞外基質(zhì)分泌旺盛,可作為種子細(xì)胞。 2、軟骨細(xì)胞可較好的在藻酸鈣中生長(zhǎng)、增殖,低、中強(qiáng)度組的超聲能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞在三維培養(yǎng)環(huán)境下的生長(zhǎng)及Ⅱ型膠原的表達(dá),低強(qiáng)度組超聲(F0:1MHZ, PRF:1kHZ, Amp:50mv, Cycle:50)的促進(jìn)作用更為明顯,而高強(qiáng)度組的LIPUS則抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)及Ⅱ型膠原的表達(dá)。 3、第4、8、12周時(shí)大體觀察及組織學(xué)觀察提示LIPUS-及LIPUS+的缺損區(qū)為透明軟骨樣組織,而Control則多為纖維樣軟骨組織,同一時(shí)期的LIPUS+修復(fù)效果較LIPUS-好。各組的wakitani組織學(xué)評(píng)分隨時(shí)間推移而呈現(xiàn)遞減趨勢(shì),4周時(shí)LIPUS+與Control相比有明顯差異(P0.01),LIPUS-組與Control比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P小于0.05),但LIPUS+與LIPUS-相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),8、12周時(shí)兩治療組與Control相比均有明顯差異(P0.01),兩治療組間相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 結(jié)論： 1、利用機(jī)械法聯(lián)合酶消化法能獲得大量生物活性強(qiáng)的軟骨細(xì)胞。 2、采用本實(shí)驗(yàn)中的方法可制備出符合實(shí)驗(yàn)需求的、具有特定形狀的軟骨細(xì)胞／藻酸鈣凝膠復(fù)合物。一定強(qiáng)度的超聲(F0:1MHZ, PRF:1kHZ, Amp:50mv, Cycle:50)能夠優(yōu)化組織工程化軟骨的構(gòu)建。 3、軟骨細(xì)胞／藻酸鈣凝膠復(fù)合物及LIPUS優(yōu)化的凝膠復(fù)合物均可通過(guò)促進(jìn)軟骨缺損修復(fù)區(qū)的軟骨細(xì)胞增殖、Ⅱ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的分泌、降低wakitani評(píng)分從而起到修復(fù)軟骨缺損的作用,相比較而言,LIPUS優(yōu)化的凝膠復(fù)合物修復(fù)軟骨缺損的效果更為顯著。
【關(guān)鍵詞】：低強(qiáng)度脈沖超聲 組織工程化軟骨 軟骨缺損 修復(fù)
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照12-13
• 前言13-15
• 第一部分 兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定15-23
• 1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>15
• 2 實(shí)驗(yàn)材料15-16
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物15
• 2.2 主要實(shí)驗(yàn)器械15
• 2.3 實(shí)驗(yàn)耗材與儀器15
• 2.4 主要試劑及藥物15-16
• 2.5 主要試劑的配制16
• 3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟16-18
• 3.1 軟骨細(xì)胞的體外分離及培養(yǎng)16-17
• 3.2 軟骨細(xì)胞的傳代培養(yǎng)17
• 3.3 軟骨細(xì)胞的凍存17
• 3.4 軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及功能學(xué)特性的鑒定17-18
• 3.4.1 軟骨細(xì)胞的鏡下觀察17
• 3.4.2 細(xì)胞爬片的制備17-18
• 3.4.3 甲苯胺藍(lán)染色18
• 3.4.4 Ⅱ型膠原免疫組化染色18
• 4 結(jié)果18-19
• 4.1 倒置顯微鏡下觀察18-19
• 4.2 軟骨細(xì)胞功能學(xué)特性的鑒定19
• 4.2.1 甲苯胺藍(lán)染色19
• 4.2.2 Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)19
• 5 討論19-20
• 5.1 關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的種子細(xì)胞19-20
• 5.2 軟骨細(xì)胞的分離方法20
• 5.3 軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)20
• 6 結(jié)論20-21
• 附圖21-23
• 第二部分 軟骨細(xì)胞/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的配制及優(yōu)化凝膠復(fù)合物的最佳超聲參數(shù)篩選23-33
• 1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>23
• 2 實(shí)驗(yàn)材料23-24
• 2.1 種子細(xì)胞23
• 2.2 主要實(shí)驗(yàn)器械23
• 2.3 實(shí)驗(yàn)耗材與儀器23
• 2.4 主要試劑及藥物23-24
• 2.5 主要試劑的配制24
• 3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟24-25
• 3.1 制備藻酸鈉/軟骨細(xì)胞懸液24
• 3.2 制備圓柱形軟骨細(xì)胞/藻酸鈣凝膠復(fù)合物24-25
• 3.3 篩選最佳超聲參數(shù)改良軟骨細(xì)胞/藻酸鈣凝膠復(fù)合物25
• 4 主要檢測(cè)指標(biāo)25
• 4.1 CCK-8檢測(cè)軟骨細(xì)胞數(shù)量25
• 4.2 免疫組化檢測(cè)軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原的表達(dá)量25
• 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理25-26
• 6 結(jié)果26-28
• 6.1 CCK-8檢測(cè)不同組別凝膠內(nèi)軟骨細(xì)胞數(shù)量26
• 6.2 免疫組化檢測(cè)不同組別凝膠中軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)情況26-28
• 7 討論28-30
• 7.1 三維培養(yǎng)的意義28
• 7.2 三維培養(yǎng)的支架材料28
• 7.3 構(gòu)建組織工程化軟骨的種子細(xì)胞濃度28-29
• 7.4 超聲優(yōu)化軟骨細(xì)胞/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的構(gòu)建29-30
• 8 結(jié)論30-31
• 附圖31-33
• 第三部分 經(jīng)超聲優(yōu)化的軟骨細(xì)胞/藻酸鈣凝膠復(fù)合物修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損33-46
• 1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>33
• 2 實(shí)驗(yàn)材料33-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物33
• 2.2 主要實(shí)驗(yàn)器械33
• 2.3 實(shí)驗(yàn)耗材與儀器33
• 2.4 主要試劑及藥物33-34
• 2.5 主要試劑的配制34
• 3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟34-35
• 3.1 軟骨細(xì)胞/藻酸鈣凝膠復(fù)合物的制備及超聲干預(yù)34
• 3.2 制造兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型34-35
• 3.3 實(shí)驗(yàn)分組35
• 4 主要觀察指標(biāo)35-37
• 4.1 一般情況觀察35
• 4.2 修復(fù)組織的大體觀察35
• 4.3 修復(fù)組織的組織學(xué)觀察35-36
• 4.3.1 標(biāo)本的HE染色35
• 4.3.2 番紅O染色35-36
• 4.3.3 Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)36
• 4.4 組織學(xué)評(píng)分36-37
• 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理37
• 6 結(jié)果37-39
• 6.1 一般情況觀察37
• 6.2 修復(fù)組織大體觀察37-38
• 6.3 修復(fù)組織的組織學(xué)觀察38
• 6.4 組織學(xué)評(píng)分38-39
• 7 討論39-41
• 7.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉劑的選擇及模型的制備39-40
• 7.2 軟骨損傷的中醫(yī)藥治療40
• 7.3 LIPUS的類生長(zhǎng)因子作用40-41
• 8 結(jié)論41-42
• 附圖42-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 第四部分 結(jié)論與展望50-51
• 1 結(jié)論50
• 2 展望50-51
• 綜述51-57
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 攻讀碩士期間獲得的研究成果57-58
• 致謝58

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王小紅;王洪;楊述華;唐欣;段德宇;孟春慶;邵增務(wù);杜靖遠(yuǎn);;低強(qiáng)度脈沖式超聲對(duì)實(shí)驗(yàn)性兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷修復(fù)的影響[J];國(guó)際骨科學(xué)雜志;2009年03期

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本文編號(hào)：432440