本文關(guān)鍵詞：兔骨髓間充質(zhì)干細胞定向成骨誘導復合異種松質(zhì)骨修復兔尺骨骨缺損的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 研究經(jīng)定向成骨誘導的兔骨髓間充質(zhì)干細胞復合異種松質(zhì)骨移植修復兔尺骨骨缺損的能力及特點，為骨組織工程治療骨缺損選擇理想的種子細胞來源及合適的支架材料尋求一種新的方法。 方法 先取新生24h內(nèi)新西蘭大白兔顱蓋骨，采用改良酶消化法提取兔成骨細胞（osteoblast，OB）；再取2周齡新西蘭大白兔四肢長骨，采用密度梯度離心法提取骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）。通過細胞形態(tài)學觀察、細胞化學染色、MTT法測定細胞增殖等檢測，對兩種原代細胞進行鑒定。 取第3代BMSCs和OB，應(yīng)用Transwell雙層細胞培養(yǎng)板將兩種細胞共同培養(yǎng)，實驗共設(shè)三組：A組上室接種OB，B組和C組上室均未接種細胞，B組使用成骨誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)，C組使用BMSCs生長液培養(yǎng)作為空白對照，三組培養(yǎng)下室均接種BMSCs。通過細胞形態(tài)學觀察、茜素紅染色、BMSCs上清液中堿性磷酸酶和骨鈣素測定，RT-PCR檢測骨鈣素和Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達，對誘導后的細胞進行鑒定。 取檢疫合格的豬股骨髁部松質(zhì)骨，經(jīng)處理制成異種松質(zhì)骨。使用前BMSCs生長液浸泡6h，晾干后接種定向成骨誘導的BMSCs，體外培養(yǎng)一周，顯微鏡下觀察成骨誘導的BMSCs在異種松質(zhì)骨支架上的粘附、生長情況，MTT法測定支架材料上細胞增殖情況。 取6月齡新西蘭大白兔36只，采用完全隨機抽樣的方法，抽取30只新西蘭大白兔每組15只作為實驗組和對照組，其余6只作為空白對照組，隨機選取一側(cè)前肢制作尺骨中段15mm節(jié)段性骨缺損模型。按照植入物不同分為三組：實驗組：缺損處植入成骨誘導的BMSCs復合異種松質(zhì)骨；對照組：缺損處植入異種松質(zhì)骨；空白對照組：不植入任何材料。于術(shù)后4、8、12周3個時間點每組處死5只實驗動物取標本，，通過X線檢查、標本大體觀察和骨缺損區(qū)HE染色，及術(shù)后12周兔尺骨缺損區(qū)幾何參數(shù)測量，比較各組骨缺損的修復情況。 結(jié)果 1.細胞的提取和鑒定：密度梯度離心法提取BMSCs，操作簡單、細胞純度高，得到的細胞呈長梭形；改良酶消化法提取成骨細胞，耗時短、細胞產(chǎn)出率高，得到的細胞呈短梭形或多角形。兩種原代細胞經(jīng)鑒定為骨髓間充質(zhì)干細胞和成骨細胞。 2. BMSCs定向成骨誘導分化：Transwell雙層細胞培養(yǎng)板法和成骨誘導液培養(yǎng)法兩組細胞上清液中AKP、OCN含量在同時間檢測點上檢測結(jié)果顯示兩者無明顯差異（P0.05），兩組成骨誘導后的細胞茜素紅染色均為陽性，RT-PCR檢測兩組成骨誘導的細胞OCN和CollagenⅠ的mRNA均有表達。 3.異種松質(zhì)骨的制備與成骨誘導的BMSCs復合培養(yǎng)：經(jīng)去抗原處理后的異種松質(zhì)骨，外觀呈白色至淡黃色、疏松多孔狀。接種細胞后顯微鏡下觀察細胞在異種松質(zhì)骨支架材料上生長良好，MTT法測定結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時間增加細胞數(shù)量增多。 4.骨缺損修復實驗：X線觀察:術(shù)后4、8、12周顯示實驗組骨缺損區(qū)骨痂量明顯多于對照組及空白對照組。X線評分結(jié)果：各組均隨時間延長得分逐漸增多，實驗組與其他各組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P 0.05)。HE染色:術(shù)后4、8、12周實驗組形成的編織骨量明顯多于對照組和空白對照組。術(shù)后12周標本幾何參數(shù)測量：實驗組尺骨骨痂中分處的冠狀徑、矢狀徑和骨痂厚度明顯大于對照組和空白對照組，統(tǒng)計學分析差異有統(tǒng)計學意義(P 0.05)。 結(jié)論 1.密度梯度離心法提取BMSCs和改良酶消化法提取成骨細胞是較為優(yōu)良的原代細胞提取方法。 2.Transwell雙層細胞培養(yǎng)板法能使BMSCs定向誘導為成骨細胞，但不適合大規(guī)模應(yīng)用。 3.經(jīng)檢測豬骨組織與成骨誘導的BMSCs組織相容性好，異種骨可作為組織工程骨的支架材料。 4.成骨誘導的BMSCs復合異種松質(zhì)骨具有良好的修復性能，可以成為骨缺損修復的一種新途徑。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細胞 成骨細胞 誘導分化 骨缺損 異種松質(zhì)骨
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 目錄10-11
• 符號說明：中英文縮略詞說明11-12
• 引言12-14
• 材料與方法14-30
• 結(jié)果30-37
• 討論37-42
• 結(jié)論42-43
• 附圖43-50
• 參考文獻50-55
• 綜述55-64
• 參考文獻61-64
• 個人簡歷64-65
• 基本信息64
• 教育背景64
• 在學期間發(fā)表論文與研究成果64-65
• 致謝65

【參考文獻】

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本文編號：423268