發(fā)布時間：2017-06-05 08:09

  本文關(guān)鍵詞：兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨誘導(dǎo)復(fù)合異種松質(zhì)骨修復(fù)兔尺骨骨缺損的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 研究經(jīng)定向成骨誘導(dǎo)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合異種松質(zhì)骨移植修復(fù)兔尺骨骨缺損的能力及特點，為骨組織工程治療骨缺損選擇理想的種子細(xì)胞來源及合適的支架材料尋求一種新的方法。 方法 先取新生24h內(nèi)新西蘭大白兔顱蓋骨，采用改良酶消化法提取兔成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）；再取2周齡新西蘭大白兔四肢長骨，采用密度梯度離心法提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞化學(xué)染色、MTT法測定細(xì)胞增殖等檢測，對兩種原代細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 取第3代BMSCs和OB，應(yīng)用Transwell雙層細(xì)胞培養(yǎng)板將兩種細(xì)胞共同培養(yǎng)，實驗共設(shè)三組：A組上室接種OB，B組和C組上室均未接種細(xì)胞，B組使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)，C組使用BMSCs生長液培養(yǎng)作為空白對照，三組培養(yǎng)下室均接種BMSCs。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、茜素紅染色、BMSCs上清液中堿性磷酸酶和骨鈣素測定，RT-PCR檢測骨鈣素和Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)，對誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 取檢疫合格的豬股骨髁部松質(zhì)骨，經(jīng)處理制成異種松質(zhì)骨。使用前BMSCs生長液浸泡6h，晾干后接種定向成骨誘導(dǎo)的BMSCs，體外培養(yǎng)一周，顯微鏡下觀察成骨誘導(dǎo)的BMSCs在異種松質(zhì)骨支架上的粘附、生長情況，MTT法測定支架材料上細(xì)胞增殖情況。 取6月齡新西蘭大白兔36只，采用完全隨機抽樣的方法，抽取30只新西蘭大白兔每組15只作為實驗組和對照組，其余6只作為空白對照組，隨機選取一側(cè)前肢制作尺骨中段15mm節(jié)段性骨缺損模型。按照植入物不同分為三組：實驗組：缺損處植入成骨誘導(dǎo)的BMSCs復(fù)合異種松質(zhì)骨；對照組：缺損處植入異種松質(zhì)骨；空白對照組：不植入任何材料。于術(shù)后4、8、12周3個時間點每組處死5只實驗動物取標(biāo)本，，通過X線檢查、標(biāo)本大體觀察和骨缺損區(qū)HE染色，及術(shù)后12周兔尺骨缺損區(qū)幾何參數(shù)測量，比較各組骨缺損的修復(fù)情況。 結(jié)果 1.細(xì)胞的提取和鑒定：密度梯度離心法提取BMSCs，操作簡單、細(xì)胞純度高，得到的細(xì)胞呈長梭形；改良酶消化法提取成骨細(xì)胞，耗時短、細(xì)胞產(chǎn)出率高，得到的細(xì)胞呈短梭形或多角形。兩種原代細(xì)胞經(jīng)鑒定為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞。 2. BMSCs定向成骨誘導(dǎo)分化：Transwell雙層細(xì)胞培養(yǎng)板法和成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)法兩組細(xì)胞上清液中AKP、OCN含量在同時間檢測點上檢測結(jié)果顯示兩者無明顯差異（P0.05），兩組成骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞茜素紅染色均為陽性，RT-PCR檢測兩組成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞OCN和CollagenⅠ的mRNA均有表達(dá)。 3.異種松質(zhì)骨的制備與成骨誘導(dǎo)的BMSCs復(fù)合培養(yǎng)：經(jīng)去抗原處理后的異種松質(zhì)骨，外觀呈白色至淡黃色、疏松多孔狀。接種細(xì)胞后顯微鏡下觀察細(xì)胞在異種松質(zhì)骨支架材料上生長良好，MTT法測定結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時間增加細(xì)胞數(shù)量增多。 4.骨缺損修復(fù)實驗：X線觀察:術(shù)后4、8、12周顯示實驗組骨缺損區(qū)骨痂量明顯多于對照組及空白對照組。X線評分結(jié)果：各組均隨時間延長得分逐漸增多，實驗組與其他各組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.05)。HE染色:術(shù)后4、8、12周實驗組形成的編織骨量明顯多于對照組和空白對照組。術(shù)后12周標(biāo)本幾何參數(shù)測量：實驗組尺骨骨痂中分處的冠狀徑、矢狀徑和骨痂厚度明顯大于對照組和空白對照組，統(tǒng)計學(xué)分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.05)。 結(jié)論 1.密度梯度離心法提取BMSCs和改良酶消化法提取成骨細(xì)胞是較為優(yōu)良的原代細(xì)胞提取方法。 2.Transwell雙層細(xì)胞培養(yǎng)板法能使BMSCs定向誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，但不適合大規(guī)模應(yīng)用。 3.經(jīng)檢測豬骨組織與成骨誘導(dǎo)的BMSCs組織相容性好，異種骨可作為組織工程骨的支架材料。 4.成骨誘導(dǎo)的BMSCs復(fù)合異種松質(zhì)骨具有良好的修復(fù)性能，可以成為骨缺損修復(fù)的一種新途徑。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨細(xì)胞 誘導(dǎo)分化 骨缺損 異種松質(zhì)骨
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 目錄10-11
• 符號說明：中英文縮略詞說明11-12
• 引言12-14
• 材料與方法14-30
• 結(jié)果30-37
• 討論37-42
• 結(jié)論42-43
• 附圖43-50
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 綜述55-64
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 個人簡歷64-65
• 基本信息64
• 教育背景64
• 在學(xué)期間發(fā)表論文與研究成果64-65
• 致謝65

【參考文獻(xiàn)】

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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本文編號：423268