發(fā)布時間：2017-06-04 10:07

  本文關鍵詞：醫(yī)用殼多糖表面包覆技術處理納米氧化鐵磁珠的技術研發(fā)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景： 核酸是儲存、復制和傳遞遺傳信息的物質基礎，是生物體正常的生長、發(fā)育、繁殖、以及遺傳和變異等一系列重大生命活動的關鍵物質，同時參與生命體的各種病理活動。因此無論對核酸結構、功能進行研究，還是對基因工程、蛋白質工程等進行研究，對核酸進行分離純化是首要解決的問題。核酸提取基本原理是利用各種方法，破裂細胞壁或細胞膜，使染色體及蛋白質發(fā)生變性反應，再用某些有機溶劑萃取核酸，然后經(jīng)過沉淀、洗脫等過程，從而獲取核酸。傳統(tǒng)的核酸分離技術包含沉淀和離心等過程，該純化方法的步驟繁雜、耗時長、提取率低，提取過程中會接觸到有毒試劑，自動化程度低；而采用磁性載體微球分離技術則可較好的避免這些缺點，可實現(xiàn)核酸的高效、快速提取，是今后核酸純化方法發(fā)展的一個重要方向。 納米磁珠純化技術與20世紀70年代興起，納米磁性顆粒因其獨特的性能，在生物醫(yī)學領域得到了廣泛應用,如細胞分離、核酸提取、藥物載體與免疫識別等。納米磁珠一般由磁性內核及高分子外殼構成，可在磁場中定向運動，且可與多種活性物質結合，如抗原、核酸、抗體等結合，因此納米磁珠是提取核酸優(yōu)良的載體。納米磁珠法提純核酸不需要離心和使用有機溶劑，操作安全簡單。但目前磁珠提取核酸分子的試劑盒以及儀器費用較高，難以在臨床核酸提取中得到普及應用。因此，研發(fā)一種種基于納米磁珠為介質的新型核酸吸附-提取技術具有重要的臨床意義。我們根據(jù)傳統(tǒng)核酸提取技術的不足，自主研發(fā)了基于現(xiàn)有比較成熟的磁珠提取技術-納米氧化鐵磁珠表面包覆醫(yī)用殼聚糖新型磁珠的提取技術，為人體全血核酸的提取提供了簡易便捷的新方法。 目的： 研制一種新型殼聚糖納米氧化鐵磁珠，檢測其理化性能，并觀察其在提取人血DNA檢測中的應用效果。 方法： 采用凝聚沉淀的方法，通過在納米氧化鐵磁珠表面包覆一層殼聚糖分子，制備出殼聚糖納米氧化鐵磁珠。對磁珠的粒徑大小、顯微特征、殼聚糖外殼和磁珠內核的關系以及殼聚糖磁珠的理化性能進行檢測、分析；采購人體全血標本，分別用殼多糖表面納米氧化鐵磁珠及硅基磁珠提取人血標本DNA，并用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察及核酸微量測定儀分析。結果： 1．電鏡下觀察殼聚糖表面包覆納米氧化鐵磁珠，磁珠分散性良好，無凝聚成團，覆蓋約70%。 2．在透射電子顯微鏡下可見，殼聚糖納米氧化鐵磁珠呈圓形顆粒狀，，形態(tài)、大小基本一致，磁珠分布均勻，粒徑約在100~200nm之間。 3．XRD檢測結果顯示其衍射峰位置與標準參數(shù)相一致，這些特征峰衍射角2θ出現(xiàn)在18.5°、30.2°、35.6°、37.2°、43.0°、53.4°、57.1°和62.5°分別對應于的晶面指數(shù)(111)、(220)、(311)、(222)、(400)、(422)、(511)和(440)，而且沒有其它雜質峰出現(xiàn)，說明樣品中所含磁性核心為Fe3O4，單相立方晶型，產(chǎn)物純度高。 4．紅外光譜圖顯示，殼聚糖納米氧化鐵磁珠的特征吸收峰出現(xiàn)在約3400cm-1、2370cm-1、1630cm-1和1080cm-1處，這與殼聚糖所帶的基分子間氫鍵、甲基、酮羰基、醇羥基相對應，證明殼聚糖被包覆在磁珠表面，且通過氫鍵范德華力和靜電作用等方式結合。 5．過真空干燥后的粉末殼聚糖包覆納米氧化鐵磁珠的磁滯回線。結果顯示磁珠的磁化強度在場強為-18000Oe時開始提高，-3000Oe~3000Oe區(qū)間提升最為明顯，在20000Oe時基本達到飽和程度，該磁滯回線呈一條曲線、矯頑力趨近于零、幾乎沒有磁滯，具有良好的超順磁性，飽和磁化強度為52.9emu/g。 6．殼聚糖納米氧化鐵磁珠在交變磁場中，隨著時間的延長，其溫度逐漸上升，溫度與時間呈線性相關。 7．異丙醇替代液組的磁珠提取人血DNA電泳條帶明顯比原結合液組清晰，且異丙醇替代液組其260nm吸光度值（260nm Abs）及目標DNA濃度（conc）明顯高于原結合液組，證明異丙醇在DNA提取過程中起到了優(yōu)化作用。 8．殼聚糖納米氧化鐵磁珠每條跑道上均可見DNA條帶片段，硅基磁珠電泳條帶更清晰、明亮；殼聚糖納米氧化鐵磁珠組其260nm Abs及conc值均明顯低于硅基納米氧化鐵磁珠組（p＜0.05），提示殼聚糖納米氧化鐵磁珠提取的全血DNA濃度較低，提取效果不如硅基納米氧化鐵磁珠。同時發(fā)現(xiàn)，殼聚糖納米氧化鐵磁珠組其OD260/280為1.8713±0.0825，提示不存在RNA、蛋白質、酚等污染，但OD260/230為0.4613±0.0770，明顯低于2.0，提示提取的DNA樣品中可能有鹽和小分子雜質，如核苷酸、氨基酸、酚等污染。 結論： 成功制備了新型殼聚糖納米氧化鐵磁珠，其操作簡便、易行，制備出的殼聚糖納米氧化鐵磁珠粒徑均勻，成球性與穩(wěn)定性好，且成功提取了人血DNA，為靶向藥物載體、細胞分離、核酸提取等應用提供了實驗材料，但仍比較硅基提取效果差，其提純濃度和純度并非十分理想，提取方法值得繼續(xù)深入研究。
【關鍵詞】：殼聚糖納米氧化鐵磁珠 制備 沉淀 理化性能 核酸 氧化鐵
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• Abstract5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 殼聚糖表面包覆納米氧化鐵磁珠的制備及理化性能的測定15-24
• 2.1 材料與方法15-17
• 2.2 結果17-21
• 2.3 討論21-24
• 第三章 殼聚糖包覆納米氧化鐵磁珠在臨床檢驗中的應用24-32
• 3.1 材料和方法25-28
• 3.2 結果28-31
• 3.3 討論31-32
• 全文總結32-33
• 參考文獻33-44
• 文獻綜述44-53
• 參考文獻50-53
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文53-54
• 致謝54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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  本文關鍵詞：醫(yī)用殼多糖表面包覆技術處理納米氧化鐵磁珠的技術研發(fā)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：420657