本文關鍵詞：組織工程纖維環(huán)-髓核復合組織的構建及評估，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:1.評估絲素蛋白來源的一體化纖維環(huán)-髓核(AF-NP)支架作為組織工程椎間盤支架的可行性。2.探討取向性聚己內酯(PCL)纖維環(huán)支架復合兔AF細胞體外構建組織工程纖維環(huán)的可行性。3.探討以取向PCL/海藻酸鈉水凝膠復合兔椎間盤AF細胞和NP細胞裸鼠皮下構建組織工程椎間盤的可行性。方法:1.以絲素蛋白溶液為原料,分別采用石蠟球致孔法和相分離法制備三維多孔一體化AF-NP支架。采用體視顯微鏡、掃描電鏡(SEM)觀察支架內部結構,測定雙相支架AF相和NP相的孔徑、孔隙率及一體化支架壓縮彈性模量;分離培養(yǎng)兔AF細胞和NP細胞,接種至雙相支架的相應部位,體外培養(yǎng)48 h,SEM、Live/dead、HE染色評價支架與細胞的生物相容性;CCK-8檢測細胞的增殖活性。2.以PCL為材料,采用濕紡-成形法制備環(huán)形取向微米纖維環(huán)支架。采用體式顯微鏡、SEM、Micro-CT觀察支架表面形態(tài)、纖維直徑,測定支架的孔隙率。分離培養(yǎng)兔AF細胞并接種至PCL支架上,體外培養(yǎng)。通過SEM、Live/dead、鬼筆環(huán)肽染色、Di I熒光標記,觀察細胞在支架上的活性、形態(tài)、黏附、遷移情況,評價支架生物相容性。分別于體外培養(yǎng)1周、3周組織學染色觀察,并行MTT檢測及蛋白多糖、膠原生化定量分析;RT-PCR檢測AF細胞蛋白聚糖及Ⅰ、Ⅱ型膠原基因表達;同時檢測其力學性能。3.以PKH26標記的AF細胞接種到取向PCL纖維支架,復合海藻酸鈉水凝膠包裹PKH67標記的NP細胞,體外培養(yǎng)1周后,植入裸鼠皮下構建組織工程椎間盤;體內培養(yǎng)8周后,動物活體熒光成像系統檢測椎間盤細胞體內熒光分布情況;復合物植入4周、8周后,取材、冰凍切片,觀察細胞熒光情況,行組織學染色評估;同時分析其力學性能。結果:1.體視顯微鏡和SEM見支架AF相和NP相均呈相互連通的多孔結構,孔隙高度連通,交接區(qū)域結合緊密;AF相孔徑為(220.0±23.1)μm,NP相孔徑為(90.0±17.8)μm;孔隙率分別為91%和93%;一體化支架壓縮彈性模量為(150.7±6.8)k Pa。SEM和HE染色見細胞均勻地黏附在支架表面,細胞周圍有細胞外基質分泌;Live/dead染色顯示細胞活性良好;CCK-8增殖分析顯示兩種細胞均具有良好的增殖活性。2.體式顯微鏡、SEM、Micro-CT示PCL纖維排列呈平行取向,纖維表面光滑、規(guī)則,直徑均勻。纖維直徑(16.13±2.77)μm,孔隙率(69.33±6.67)%。SEM見細胞長梭形粘附在支架上;Live/dead染色示細胞活性良好;鬼筆環(huán)肽染色示細胞肌絲沿PCL纖維取向性伸展;Di I熒光標記示細胞遷移滲透到支架內部;組織學染色顯示細胞及細胞外基質均沿微米纖維取向性分布,且21天染色陽性強度較7天增強;MTT分析,蛋白多糖、Ⅰ、Ⅱ型膠原生化定量檢測顯示細胞增殖明顯,細胞外基質分泌逐漸增加(P0.05);RT-PCR顯示細胞Ⅰ、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖基因表達逐漸增加(P0.05)。壓縮模量和拉伸模量均隨培養(yǎng)時間增加而逐漸增加。3.組織工程化椎間盤大體觀察見圓盤狀類椎間盤樣組織;活體熒光成像系統顯示在AF相強紅色熒光,NP相上弱綠色熒光,其他位置未見明顯熒光;植入4周、8周后取材切片,熒光顯微鏡下觀察見AF細胞呈紅色熒光標記的長梭形取向性生長,NP細胞呈綠色熒光標記的圓形或短梭形生長,交界區(qū)域未見兩種細胞的明顯遷移混合;HE染色可見支架內部有大量圓形或短梭形細胞;蕃紅-O染色示AF相與NP相均呈陽性,NP相陽性強度強于AF相;AF相Ⅰ型膠原免疫組化染色、NP相Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陽性,且8周組染色陽性強度增強。力學性能分析顯示細胞支架復合物壓縮模量隨植入時間增加而逐漸增加。結論:1.以天然絲素蛋白構建一體化AF-NP支架,具有良好的孔徑、孔隙率和細胞相容性,具有優(yōu)越的力學性能,適合作為組織工程椎間盤支架。2.濕紡-成形法制備環(huán)形取向性PCL微米纖維支架復合兔AF細胞能夠構建在解剖結構、生化組成及力學性能上與天然纖維環(huán)組織相似的組織。3.以取向PCL纖維/海藻酸鈉水凝膠復合兔椎間盤AF細胞和NP細胞在裸鼠皮下能夠構建在微觀結構、生化組成、力學性能上與天然椎間盤相似的組織工程化椎間盤。
【關鍵詞】：椎間盤 組織工程 支架 絲素蛋白 聚己內酯(PCL) 海藻酸鈉
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08;R681.53
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語11-12
• 前言12-15
• 研究現狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、絲素蛋白來源的一體化纖維環(huán)-髓核支架的制備與評估15-25
• 1.1 對象和方法15-19
• 1.1.1 實驗材料及試劑15
• 1.1.2 實驗試劑配制15-16
• 1.1.3 實驗儀器16
• 1.1.4 實驗方法16-19
• 1.2 結果19-23
• 1.2.1 絲素蛋白一體化AF-NP支架的評估19-20
• 1.2.2 一體化AF-NP支架的細胞相容性評估20-23
• 1.3 討論23-24
• 1.3.1 組織工程椎間盤的特點23
• 1.3.2 支架材料研究進展和選擇23
• 1.3.3 一體化支架的理化特性23-24
• 1.3.4 一體化支架的細胞相容性24
• 1.4 小結24-25
• 二、取向性聚己內酯纖維環(huán)支架復合兔纖維環(huán)細胞體外構建組織工程纖維環(huán)25-43
• 2.1 對象和方法25-34
• 2.1.1 實驗材料及試劑25
• 2.1.2 實驗試劑配制25-26
• 2.1.3 實驗儀器26
• 2.1.4 實驗方法26-34
• 2.2 結果34-40
• 2.2.1 環(huán)形取向PCL微米纖維環(huán)支架微觀結構和理化性能評估34
• 2.2.2 組織工程纖維環(huán)中纖維環(huán)細胞行為評價34-35
• 2.2.3 組織學染色分析35
• 2.2.4 蛋白多糖、I型膠原、II型膠原定量分析35
• 2.2.5 纖維環(huán)細胞外基質的相關基因表達分析35
• 2.2.6 力學性能分析35-40
• 2.3 討論40-42
• 2.3.1 取向PCL微米纖維支架的制備40
• 2.3.2 PCL微米纖維支架細胞行為的影響40-41
• 2.3.3 組織工程纖維環(huán)的形成41
• 2.3.4 力學性能分析41-42
• 2.4 小結42-43
• 三、裸鼠皮下構建仿生化組織工程椎間盤43-52
• 3.1 對象和方法43-45
• 3.1.1 實驗材料及試劑43
• 3.1.2 實驗試劑配制43
• 3.1.3 實驗儀器43
• 3.1.4 實驗方法43-45
• 3.2 結果45-50
• 3.2.1 大體觀察45
• 3.2.2 活體熒光成像分析45
• 3.2.3 組織工程化椎間盤熒光檢測45-46
• 3.2.4 組織學分析46
• 3.2.5 力學性能分析46-50
• 3.3 討論50-51
• 3.3.1 仿生組織工程椎間盤的構建50
• 3.3.2 熒光標記與活體熒光成像50-51
• 3.3.3 裸鼠皮下異位構建仿生組織工程化椎間盤的可行性51
• 3.4 小結51-52
• 結論52-53
• 參考文獻53-60
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明60-62
• 綜述 椎間盤退變信號轉導機制的研究進展62-70
• 綜述參考文獻67-70
• 致謝70

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