目的異源表達(dá)并純化結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)H37Rv的Rv1872c蛋白,探討抗Mtb藥物新型靶點(diǎn)。方法 PCR擴(kuò)增Rv1872c編碼基因,構(gòu)建融合表達(dá)載體pET-Rv1872c,并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中,加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。用Co2+親和層析純化Rv1872c融合蛋白,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析,證明Rv1872c融合蛋白在E.coli中完全以包涵體形式表達(dá),其亞基相對(duì)分子質(zhì)量約46 200,且在變性條件下,經(jīng)親和層析獲得高純度的Rv1872c融合蛋白。生物信息學(xué)分析表明,Rv1872c為不穩(wěn)定的堿性蛋白,主要二級(jí)結(jié)構(gòu)元件為α-螺旋和無規(guī)則卷曲,無跨膜區(qū),推測(cè)為外周膜蛋白,且為潛在的醌依賴型L-乳酸脫氫酶。結(jié)論通過原核表達(dá)和親和層析,成功獲得了高純度的Rv1872c融合蛋白,為進(jìn)一步功能鑒定和開發(fā)抗Mtb藥物新型靶點(diǎn)提供了參考。

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圖1Rv1872c編碼基因（lldD2）擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

質(zhì)粒pET-Rv1872c的雙酶切（NdeⅠ/XhoⅠ）產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1275bp的目的條帶，見圖2。進(jìn)一步對(duì)陽性克隆進(jìn)行DNA序列分析，測(cè)序結(jié)果表明克隆的lldD2基因與數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列完全一致，表明質(zhì)粒pET-Rv1872c正確成功。圖2重組....

圖2重組質(zhì)粒pET-Rv1872c的雙酶切（NdeⅠ/XhoⅠ）產(chǎn)物電泳圖

圖1Rv1872c編碼基因（lldD2）擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖2.3表達(dá)及純化產(chǎn)物的鑒定

圖3表達(dá)及純化的Rv1872c融合蛋白的SDS-PAGE分析

Westernblot分析顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約46000處可見明顯的反應(yīng)條帶，見圖4，表明純化的重組Rv1872為帶有His標(biāo)簽的融合蛋白。圖4純化的Rv1872c融合蛋白的Westernblot分析

圖4純化的Rv1872c融合蛋白的Westernblot分析

圖3表達(dá)及純化的Rv1872c融合蛋白的SDS-PAGE分析2.4生物信息學(xué)分析

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