本文關(guān)鍵詞：TAZ和YAP介導支架表面形貌調(diào)控骨髓間充質(zhì)細胞的成骨分化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 近年來,雖然干細胞的相關(guān)研究已經(jīng)在醫(yī)學生物領(lǐng)域顯示出了廣闊的應用前景,但是仍然面臨著許多挑戰(zhàn)。其中組織工程生物材料是迫切需要解決的問題之一。組織工程包括三大要素：支架材料、種子細胞和生長因子,其中起著中心作用的是支架材料。它除了為特定的細胞提供結(jié)構(gòu)支撐外,其立體微觀的表面形貌能調(diào)節(jié)細胞的黏附、伸展和基因表達,誘導組織再生和控制組織結(jié)構(gòu),在組織工程中起著至關(guān)重要的作用。同時,信號通路對細胞的生長過程同樣起著及其重要的作用。近年來,發(fā)現(xiàn)Hippo信號是細胞增殖、分化和凋亡控制的重要信號通路。已有研究表明,Hippo信號TAZ/YAP是人類和小鼠胚胎干細胞多能性維持的必要分子,也是干細胞增殖的重要調(diào)控因子。雖然一些研究已經(jīng)揭示了細胞在微觀表面形貌上的行為,但對于細胞感應、細胞間信號傳導或細胞對表面形貌的長期反應性機制,人們依然不甚清楚。 目的： 本項目擬通過在體外細胞模型上研究Hippo信號關(guān)鍵因子TAZ和YAP介導的支架表面微米形貌調(diào)控干細胞增殖、分化的效應及機制,以及基于Hippo信號關(guān)鍵因子TAZ和YAP促進普通培養(yǎng)的BMSC增殖和成骨分化的效應及機制等的研究,明確支架表面微米形貌調(diào)控間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化、調(diào)控Hippo信號的效應和機制,以及微米形貌通過Hippo信號關(guān)鍵因子TAZ和YAP調(diào)控間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化的意義。本項目研究能深化對支架表面微米形貌調(diào)控細胞分化機制的理解,為設(shè)計更為安全有效的骨組織工程支架材料提供理論依據(jù)和實驗依據(jù)。 方法： 1.羥基磷灰石支架的構(gòu)建 Ca3(PO4)2和CaCO3定比例在高溫下反應同時注入高壓水蒸氣,粉末經(jīng)NH4Cl水溶液洗滌后干燥而成,成型后于1250℃燒結(jié)而成。 2.表面形貌的打磨羥基磷灰石支架構(gòu)建完成后,用不同規(guī)格的砂紙做表面打磨(P180,P240,P600, P800, P1200, P2000),對應的顆粒直徑分別為82μm,58.5μm,25.8μm,21.8μm,15.3μm,10.3μm。 3.表面粗糙度的測量用表面粗糙度測量儀來檢測表面面粗糙度參數(shù)：微觀不平度高度特性有關(guān)的表面粗糙度—輪廓算術(shù)平均偏差Ra和微觀不平度間距特性有關(guān)的表面粗糙度—輪廓微觀不平度的平均間距Sm。掃描電鏡觀察表面打磨形貌。 4.表面粗糙度對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響將骨髓間充質(zhì)干細胞以5*10＾4/scaffold接種,分別于接種后12h,24h,36h,48h,60h,72h,84h,96h使用Alamar Blue試劑檢測細胞的增殖情況。 5.表面粗糙度對骨髓間充質(zhì)干細胞分化的影響將骨髓間充質(zhì)干細胞以5*10＾4/scaffold接種后,成骨誘導2天、7天后檢測成骨相關(guān)基因的表達；成骨誘導7天后做堿性磷酸酶染色；成骨誘導28天后,做茜素紅礦化染色。 6.表面粗糙度對骨髓間充質(zhì)干細胞行為產(chǎn)生影響的分子機制將骨髓間充質(zhì)干細胞種植在羥基磷灰石支架表面,經(jīng)過2天的成骨誘導后,檢測成骨相關(guān)基因的表達、Hippo信號關(guān)鍵因子TAZ和YAP的表達以及敲除TAZ和YAP后,骨髓間充質(zhì)干細胞在支架表面成骨的分化,。包括ALP染色,茜素紅染色和成骨相關(guān)基因RT-PCR。 結(jié)果： 1.打磨后的羥基磷灰石支架表面掃描電鏡觀察,可見不同粗細以及深度的打磨痕跡。表面粗糙度掃描可見與微觀不平度高度特性有關(guān)的表面粗糙度—輪廓算術(shù)平均偏差Ra以及與微觀不平度間距特性有關(guān)的表面粗糙度—輪廓微觀不平度的平均間距Sm,均顯示出了與打磨顆粒直徑一致的變化。2.骨髓間充質(zhì)干細胞在打磨后的材料表面顯示出了比未打磨的材料上更強的增殖能力。3.堿性磷酸酶染色和茜素紅礦化染色顯示：打磨后的粗糙表面顯著增強了骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨能力。4.羥基磷灰石支架微米級粗糙表面形貌顯著增加了骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨基因表達,且顯著增加細胞內(nèi)Hippo信號關(guān)鍵因子YAP和TAZ的水平。慢病毒敲除TAZ和YAP之后,骨髓間充質(zhì)干細胞在微米級粗糙度表面的成骨能力和未打磨的光滑羥基磷灰石支架表面未見顯著差異。 結(jié)論：本研究中我們設(shè)計了羥基磷灰石支架,并用不同規(guī)格的砂紙做了表面粗糙度的打磨,骨髓間充質(zhì)干細胞接種于材料表面,在粗糙的材料表面顯現(xiàn)出更強的增殖和成骨分化能力,直接證明了表面形貌對于間充質(zhì)干細胞行為的影響。骨髓間充質(zhì)干細胞種植在表面打磨的羥基磷灰石支架上,表面粗糙度促進了間充質(zhì)干細胞的成骨分化,同時上調(diào)了Hippo信號關(guān)鍵因子TAZ和YAP的表達水平,且TAZ和YAP的表達水平和成骨相關(guān)基因的表達水平呈現(xiàn)出相同的趨勢。在敲除TAZ和YAP后骨髓間充質(zhì)干細胞在微米級粗糙度表面的成骨能力和未打磨的光滑羥基磷灰石支架表面未見顯著差異,證明表面形貌調(diào)控骨髓間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化,是通過TAZ和YAP起作用的。本項目的研究,能深化對支架表面微米形貌調(diào)控細胞分化機制的理解,為設(shè)計更為安全有效的骨組織工程支架材料提供理論依據(jù)和實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：支架材料 Hippo信號 骨髓間充質(zhì)干細胞 成骨細胞
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R687;R318.08
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 縮略詞表14-16
• 1 引言16-20
• 2 資料方法與結(jié)果20-38
• 2.1 材料20
• 2.2 表面粗梭度的檢測20-22
• 2.3 hBMSC的分離純化22-23
• 2.4 hBMSC的在不同粗糙度材料表面的增殖23-25
• 2 5 hBMSC的在不同粗糙度材料表面的成骨分化25-30
• 2.6. hBMSC在不同粗糙度表面的成骨能力差異的機制——hippo信號關(guān)鍵因子TAZ和YAP30-38
• 3. 討論38-42
• 4. 結(jié)論42-43
• 參考文獻43-46
• 綜述46-58
• 參考文獻53-58
• 作者簡歷及在讀期間所取得的科研成果58

【共引文獻】

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳雪;分區(qū)式組織工程脊髓修復大鼠脊髓損傷與抑制神經(jīng)組織的細胞凋亡研究[D];蘇州大學;2014年

  本文關(guān)鍵詞：TAZ和YAP介導支架表面形貌調(diào)控骨髓間充質(zhì)細胞的成骨分化，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：369447