目的:本研究致力于構(gòu)建組織工程生物活性小血管。首先用豬脫細胞的小腸粘膜下層（Small intestinal submucosa,SIS）交聯(lián)肝素與分泌型Klotho（Secreted Klotho,SKL）,再人工縫制成管狀小血管,移植入新西蘭大白兔模型中,替代一部分自體頸動脈血管。分別于術后2、3個月后取材,通過蛋白免疫印跡法（Western Blot）,組織學染色,免疫熒光等實驗技術手段,觀察頸動脈管壁的變化與內(nèi)皮化等相關指標的表達情況,以探討SKL修飾的人工血管在替代受損血管中發(fā)揮的作用,以及內(nèi)皮化的情況,為構(gòu)建組織工程化小血管提供實驗基礎。方法:1.體外條件下培養(yǎng)HEK293細胞,將其分為兩組,N組和SKL組。N組為正常組,轉(zhuǎn)染空載體。SKL組轉(zhuǎn)染帶有SKL基因的質(zhì)粒。用Western Blot技術分別對轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)基及細胞中的SKL蛋白進行檢測分析。收集轉(zhuǎn)染之后的HEK293細胞的無血清培養(yǎng)基,用蛋白純化鎳柱對SKL蛋白進行提取與純化。2.體外:將肝素和純化后的SKL蛋白交聯(lián)到脫細胞SIS膜上,分為SIS膜,SIS膜+肝素,SIS膜+肝素+SKL三組,將人臍靜脈內(nèi)皮細胞（H... 

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
1 前言
2 材料和方法
    2.1 實驗動物
    2.2 試劑與儀器
        2.2.1 主要試劑
        2.2.2 主要儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 HEK293 細胞的培養(yǎng)與過表達SKL的 HEK293 細胞的構(gòu)建
        2.3.2 SKL蛋白的純化與鑒定
        2.3.3 SKL對 HUVECs中 p-FAK,FAK,RHOA的表達調(diào)控
        2.3.4 脫細胞SIS的制備
        2.3.5 SIS的力學性能測試
        2.3.6 肝素化SIS、以及交聯(lián)SKL的肝素化SIS的制備
        2.3.7 體外HUVECs與 SIS復合培養(yǎng)-電鏡
        2.3.8 體外HUVECs與 SIS復合培養(yǎng)-CCK-8
        2.3.9 體外HUVECs與 SIS復合培養(yǎng)-免疫熒光
        2.3.10 人工血管的縫制與動物模型的建立
        2.3.11 兔血接觸實驗
        2.3.12 多普勒超聲
        2.3.13 動物模型取材及人工血管測量
        2.3.14 人工血管管腔的掃描電鏡觀察
        2.3.15 石蠟包埋與切片
        2.3.16 蘇木精-伊紅(HE)染色
        2.3.17 Masson染色
        2.3.18 OCT包埋與冰凍切片
        2.3.19 免疫熒光染色
    2.4 統(tǒng)計學分析方法
3 實驗結(jié)果
    3.1 HEK293 細胞的培養(yǎng)與過表達Klotho的 HEK293 的構(gòu)建
    3.2 SKL蛋白的純化與鑒定
    3.3 SKL上調(diào)p-FAK,FAK,RHOA在內(nèi)皮細胞的表達
    3.4 SIS成功脫細胞
    3.5 SIS的力學性能良好
    3.6 SKL成功交聯(lián)到SIS上
    3.7 體外HUVECs與 SIS復合培養(yǎng)-電鏡
    3.8 體外HUVECs與 SIS復合培養(yǎng)-CCK-8
    3.9 體外HUVECs與 SIS復合培養(yǎng)-免疫熒光
    3.10 兔血接觸實驗
    3.11 多普勒超聲
    3.12 人工血管取材
    3.13 人工血管管腔的掃描電鏡觀察
    3.14 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察人工血管管徑及組織重構(gòu)
    3.15 Masson染色觀察
    3.16 免疫熒光顯示SKL修飾的人工血管內(nèi)皮更完整
4 討論
5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評價
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝
個人簡介


【參考文獻】：
期刊論文
[1]表面納米仿生改性的組織工程血管支架材料對豬血液相容性的影響[J]. 韓本松,范存義,劉生和.  中華醫(yī)學雜志. 2006(29)



本文編號：3670117