Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1c（Runt-related transcription factor 1c,Runx1c）與成年造血以及造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell,HSC）的產(chǎn)生密切相關(guān),為了動態(tài)追蹤人早期造血發(fā)育過程中Runx1c的表達(dá),利用雙切質(zhì)粒載體聯(lián)合瞬時轉(zhuǎn)入B細(xì)胞淋巴瘤-特大（B-cell lymphoma-extra large,BCL-XL）基因的CRISPR-Cas9技術(shù)高效地構(gòu)建了人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell,hESC）來源的Runx1c-mNeonGreen報告細(xì)胞系,并經(jīng)PCR、Sanger測序驗(yàn)證構(gòu)建成功。隨后,利用免疫熒光技術(shù)、實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、畸胎瘤實(shí)驗(yàn)和數(shù)字化核型分析技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)該報告細(xì)胞系仍具有hESC樣的多能性且未發(fā)生染色體異常和變異。此外,通過hESC體外單層誘導(dǎo)造血分化方法,利用流式細(xì)胞術(shù)追蹤人早期造血發(fā)育過程中Runx1c的表達(dá),結(jié)果表明利用該報告細(xì)胞系可以動態(tài)追蹤人早期造血發(fā)育中Runx1c的表達(dá)。研究結(jié)果為闡明成年造血過程提供了新思路,并為體外產(chǎn)生功能性血細(xì)胞... 

【文章來源】：生物技術(shù)進(jìn)展. 2020,10(05)

【文章頁數(shù)】：10 頁

【部分圖文】：

利用H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細(xì)胞系追蹤成年造血過程

由2.1可知,通過CRISPR-Cas9方法成功獲得了H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細(xì)胞系,并且,其可在Matrigel包被的E8培養(yǎng)基中無限傳代。鏡下觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞仍然具有正常H1-hESC樣的形態(tài)特征(圖3A)。而實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示,H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細(xì)胞系表達(dá)多能性基因OCT4、SOX2和NANOG的水平與野生型H1-hESC沒有顯著性差異(圖3B)。同時,流式細(xì)胞分析術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)多能性蛋白Tra1-60、NANOG、OCT4的表達(dá)率均在90%以上(圖4A)。免疫熒光染色檢測胞內(nèi)蛋白和表面蛋白也證實(shí)細(xì)胞可表達(dá)多能性蛋白NANOG、OCT4和SSEA4(圖4B)。上述結(jié)果表明,已建立的H1-hESC來源的Runx1c-mNeonGreen報告細(xì)胞系仍然具有多能性。表2 不同類型的基因編輯效率Table 2 Different types of gene editing efficiency 電轉(zhuǎn)細(xì)胞系 克隆數(shù)/個 基因編輯效率 總數(shù) 純合基因型 雜合基因型 未編輯 H1-hESC 22 1 3 18 18.2%

表2 不同類型的基因編輯效率Table 2 Different types of gene editing efficiency 電轉(zhuǎn)細(xì)胞系 克隆數(shù)/個 基因編輯效率 總數(shù) 純合基因型 雜合基因型 未編輯 H1-hESC 22 1 3 18 18.2%圖4 多能性蛋白檢測


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