本文關鍵詞：應用骨髓間充質干細胞構建人工復合皮的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 將骨髓間充質干細胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs）與脫細胞豬小腸黏膜下層組織(Small Intestinal Submucosa, SIS)在體外復合培養(yǎng)構建人工復合皮膚，并應用于兔全層皮膚缺損創(chuàng)面。全面觀察其修復創(chuàng)面的能力，從而驗證其作為人工復合皮膚的可行性。 方法： （1）利用骨髓穿刺法抽取兔脛骨近端或股骨遠端骨髓，再運用密度梯度離心法及差速貼壁法分離純化BMSCs。用含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum,FBS)的DMEM/F-12培養(yǎng)基對其進行培養(yǎng)，37℃、5%CO2的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱對其進行孵育，體外培養(yǎng)擴增至第三代。觀察各代細胞形態(tài)及生長情況并對純化后的第三代細胞進行體外鑒定。用含綠色熒光蛋白（Green FluorescentProtein, GFP）基因的慢病毒對第三代BMSCs進行轉染，將其標記，達到示蹤效果。 （2）利用酶-去垢劑法制備脫細胞SIS，并行HE染色及電鏡檢查檢測脫細胞是否徹底。以密度為106/cm2將GFP-BMSCs接種于已脫細胞處理的SIS上共培養(yǎng)10天以構建人工復合皮膚，，熒光顯微鏡及電子顯微鏡下觀察GFP-BMSCs在SIS中的定植情況。 （3）在日本大耳兔背部脊柱兩側制備3個全層皮膚缺損模型并隨機分組，分為A、B、C三組。A、B組創(chuàng)面分別移植人工復合皮膚，單純脫細胞SIS，C組為空白創(chuàng)面。術后觀察全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合情況，并記錄各組創(chuàng)面完全愈合時間行統(tǒng)計學分析。分別于術后7、14、21、28天對各組創(chuàng)面大小進行測量，計算各個時間點的創(chuàng)面收縮率（創(chuàng)面收縮率=（原創(chuàng)面面積-現(xiàn)創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100％）并進行統(tǒng)計學分析。同時在上述各個時間點進行創(chuàng)面組織取材，觀察各組創(chuàng)面組織的情況如質地、厚度并進行比較分析，然后行HE染色組織學檢查，觀察各組創(chuàng)面在愈合過程中的組織學結構的改變情況。 結果： （1）運用密度梯度離心法及差速貼壁法分離純化BMSCs，倒置顯微鏡下觀察BMSCs呈梭形，生長良好，細胞克隆生長融合后可呈“魚群樣”排列；傳代培養(yǎng)時5-6天即可達80%融合，且隨著傳代，BMSCs的形態(tài)趨為均一。分離純化后的BMSCs能向脂肪細胞及成骨細胞分化。熒光顯微鏡下見轉染標記后的BMSCs生長良好，熒光強。 （2）制備的脫細胞SIS，HE染色及掃描電鏡下觀察均未見細胞殘留。人工復合皮膚成功構建：熒光顯微鏡下見GFP-BMSCs能粘附定植于SIS并在其表面伸展，生長良好；共培養(yǎng)10天后掃描電鏡下見多量細胞粘附于SIS的膠原纖維上，多呈梭形。 （3）創(chuàng)面修復實驗中，A、B、C組創(chuàng)面完全愈合時間分別為20.83±1.17d，23.50±1.05d，27.67±1.03d，A組創(chuàng)面愈合時間明顯比其他兩組短，與其他兩組相比具有明顯差異（P0.01）。在術后7、14、21、28天創(chuàng)面收縮率的比較中，A組與其他兩組相比均更小，差異非常顯著（P0.01）。在術后7、14、21、28天創(chuàng)面組織厚度的比較上，A組與其他兩組相比均更軟，更薄（與B組相比，P0.05，差異顯著；與C組相比較，P0.01，差異非常顯著）。即A組創(chuàng)面愈合時間短，創(chuàng)面收縮率小，創(chuàng)面組織較軟、薄。HE染色顯示，A組創(chuàng)面愈合前期上皮化速度快，中后期毛細血管及小血管增殖豐富，膠原纖維改建快，與其它兩組有明顯差異。 結論： （1）密度梯度法及差速貼壁法簡單易行，可以較高純度地分離擴增BMSCs，分離的BMSCs活力好，增殖能力強。 （2）酶-去垢劑法可以有效徹底地脫去SIS中的細胞。BMSCs與SIS在體外復合培養(yǎng)可構建人工復合皮。 （3）利用BMSCs構建的復合皮修復全層缺損創(chuàng)面時，能促進小血管形成及創(chuàng)面上皮化，加速創(chuàng)面愈合；能降低創(chuàng)面收縮率，使創(chuàng)面組織更薄及柔軟，從而能改善愈合質量。
【關鍵詞】：骨髓間充質干細胞 人工復合皮膚 全層皮膚缺損 創(chuàng)面修復
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R318.1
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文縮略詞表10-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料和方法13-19
• 2.1 主要試劑、主要儀器及標本來源13-14
• 2.2 BMSCs 的分離、擴增，鑒定及轉染標記14-16
• 2.2.1 BMSCs 的分離、擴增14-15
• 2.2.2 BMSCs 的鑒定15-16
• 2.2.3 BMSCs 的標記16
• 2.3 脫細胞 SIS 的制備及人工復合皮膚的構建16-17
• 2.3.1 脫細胞 SIS 的制備16-17
• 2.3.2 人工復合皮的體外構建17
• 2.4 人工復合皮膚的創(chuàng)面修復實驗17-19
• 2.4.1 動物創(chuàng)面修復實驗17-18
• 2.4.2 實驗觀察指標18
• 2.4.3 統(tǒng)計學處理18-19
• 第3章 實驗結果19-25
• 3.1 BMSCs 的分離、擴增，鑒定及轉染標記19-20
• 3.1.1 BMSCs 的分離，擴增19
• 3.1.2 BMSCs 的鑒定19-20
• 3.1.3 BMSCs 的轉染標記20
• 3.2 脫細胞 SIS 的制備及人工復合皮膚的構建20-21
• 3.2.1 脫細胞 SIS 的制備20
• 3.2.2 人工復合皮的體外構建20-21
• 3.3 人工復合皮膚的創(chuàng)面修復實驗21-25
• 3.3.1 實驗大體觀察21-22
• 3.3.2 不同時間點各組創(chuàng)面面積22
• 3.3.3 各個時間點各組創(chuàng)面收縮率的比較分析22-23
• 3.3.4 各個時間點各組創(chuàng)面組織質地及厚度的比較分析23
• 3.3.5 各組創(chuàng)面完全愈合時間及比較分析23-24
• 3.3.6 HE 染色組織學觀察24-25
• 第4章 討論25-31
• 4.1 種子細胞的選擇25-26
• 4.2 真皮支架的選擇26-27
• 4.3 實驗結果討論27-31
• 第5章 結論及展望31-32
• 致謝32-33
• 參考文獻33-35
• 附圖35-41
• 攻讀學位期間的研究成果41-42
• 綜述42-51
• 參考文獻47-51

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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9 方利君;付小兵;程飚;孫同柱;李建福;曹榮;王玉新;;骨髓間充質干細胞參與皮脂腺導管構成的初步研究[J];感染.炎癥.修復;2003年04期

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中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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  本文關鍵詞：應用骨髓間充質干細胞構建人工復合皮的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：322565