本文關(guān)鍵詞：人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架的制備與檢測(cè)及其在大鼠軟組織缺損模型中降解的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:1.制備人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架并初步檢測(cè)其脫細(xì)胞效果、成分、機(jī)械性能等指標(biāo);2.探討人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架對(duì)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hADSCs)的生物相容性及其對(duì)hADSCs成脂分化能力的影響;3.建立大鼠軟組織缺損模型,探討人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架于缺損軟組織模型內(nèi)生物降解性。方法:1.取正常脂肪組織約25g經(jīng)反復(fù)凍融、酶消化、有機(jī)溶劑提取脂質(zhì)、冷凍干燥等處理制備成人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架。大體觀察支架性狀,行HE、Masson染色、DAPI熒光染色觀察支架脫細(xì)胞效果;免疫組織化學(xué)染色觀察細(xì)胞外基質(zhì)(Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白)保留情況;掃描電鏡觀察支架顯微結(jié)構(gòu);萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測(cè)試支架機(jī)械性能;2.利用酶消化法從人體健康脂肪組織中分離提取出hADSCs,擴(kuò)增培養(yǎng)、觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞免疫表型;定向誘導(dǎo)hADSCs成脂及成骨分化,油紅O、茜素紅染色鑒定;取第3代hADSCs與人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架復(fù)合培養(yǎng),CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性;掃描電鏡觀察細(xì)胞粘附情況并成脂誘導(dǎo),14d后行細(xì)胞支架復(fù)合物冰凍切片,油紅O染色,RT-PCR檢測(cè)成脂特異性基因PPARγ、LPL mRNA表達(dá)情況;3.取清潔級(jí)雌性Wistar大鼠18只,于左側(cè)背部切除豎脊肌部分肌肉,建立軟組織缺損模型,分別于4w、8w、12w觀察肌肉缺損愈合情況;另取清潔級(jí)雌性Wistar大鼠18只,于左側(cè)背部建立軟組織缺損模型,將支架植入其中;右側(cè)直接將支架植入皮下;分別于4w、8w、12w取出植入支架,大體觀察兩側(cè)支架降解情況,比較兩組支架濕重,行HE染色觀察支架內(nèi)炎性浸潤(rùn)情況。結(jié)果:1.脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架呈海綿樣多孔結(jié)構(gòu);HE及Masson染色未見(jiàn)明顯細(xì)胞結(jié)構(gòu),可見(jiàn)排列緊密的基質(zhì)蛋白;DAPI熒光染色未見(jiàn)明顯陽(yáng)性細(xì)胞核,脫細(xì)胞徹底;免疫組織化學(xué)染色顯示支架材料Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白染色呈陽(yáng)性結(jié)果;掃描電鏡觀察支架呈多孔泡沫樣結(jié)構(gòu),孔隙相互連接,孔徑約50-60μm;萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測(cè)定支架最大載荷值低于脂肪組織;2.膠原酶消化法可成功從脂肪組織中分離培養(yǎng)出hADSCs,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),原代呈短梭形,傳代培養(yǎng)后呈長(zhǎng)梭形;流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫表型,其中CD44、CD90陽(yáng)性,CD34、CD45陰性;hADSCs成脂、成骨定向誘導(dǎo)分化后,油紅O、茜素紅染色陽(yáng)性。細(xì)胞與支架復(fù)合培養(yǎng)后,CCK-8檢測(cè)顯示A值隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷升高,細(xì)胞生長(zhǎng)良好,基質(zhì)支架對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性;掃描電鏡可見(jiàn)大量細(xì)胞粘附于支架;成脂誘導(dǎo)支架細(xì)胞復(fù)合物,油紅O染色可見(jiàn)支架內(nèi)大量紅染脂滴;RT-PCR顯示LPL、PPARγmRNA顯著高表達(dá);3.大鼠軟組織缺損模型建立后,分別于4w、8w、12w觀察可見(jiàn)軟組織缺損持續(xù)存在,未能自行填充修復(fù);將支架植入組織缺損及皮下后分別于4w、8w、12w取材,可見(jiàn)植入組織缺損處支架及皮下支架表面皆形成包膜,通過(guò)大體觀察,比較濕重,可見(jiàn)缺損組支架降解明顯快于皮下組,HE染色缺損組支架炎性浸潤(rùn)明顯高于皮下組,兩組支架均未完全降解。結(jié)論:1.利用脫細(xì)胞技術(shù)制備的人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架脫細(xì)胞徹底,具有良好的三維空間結(jié)構(gòu),細(xì)胞外基質(zhì)成分保留完好,機(jī)械性能較正常脂肪組織有所下降;2.細(xì)胞在支架上增殖、粘附、分化良好,支架生物相容性能良好;3.大鼠軟組織缺損模型建立有效,支架在體內(nèi)生物降解性能良好。
【關(guān)鍵詞】：脂肪組織工程 脫細(xì)胞 細(xì)胞外基質(zhì) 支架 間充質(zhì)干細(xì)胞 軟組織缺損
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R318.08;R687
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 縮略詞表8-12
• 前言12-15
• 第一部分 人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架的制備與檢測(cè)15-20
• 1 材料和方法15-17
• 1.1 材料15
• 1.2 主要試劑和儀器15-16
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法16-17
• 1.3.1 人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架的制備16
• 1.3.2 大體觀察16
• 1.3.3 組織學(xué)觀察16
• 1.3.4 DNA殘留觀察16
• 1.3.5 免疫組織化學(xué)染色觀察16
• 1.3.6 掃描電鏡觀察16
• 1.3.7 機(jī)械性能檢測(cè)16-17
• 1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析17
• 2 結(jié)果17-18
• 2.1 大體觀察17
• 2.2 組織學(xué)觀察17
• 2.3 DNA殘留觀察17
• 2.4 免疫組織化學(xué)染色觀察17
• 2.5 掃描電鏡觀察17-18
• 2.6 機(jī)械性能檢測(cè)18
• 3 討論18-20
• 第二部分 人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架生物相容性的體外研究20-27
• 1 材料與方法20-23
• 1.1 材料來(lái)源20
• 1.2 主要試劑和儀器20-21
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法21-23
• 1.3.1 hADSCs的分離、培養(yǎng)21
• 1.3.2 hADSCs的表型鑒定21
• 1.3.3 hADSCs定向成脂誘導(dǎo)分化21-22
• 1.3.4 hADSCs定向成骨誘導(dǎo)分化22
• 1.3.5 人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架的制備22
• 1.3.6 支架對(duì)細(xì)胞毒性測(cè)定22
• 1.3.7 細(xì)胞粘附觀察22
• 1.3.8 細(xì)胞外基質(zhì)支架上細(xì)胞成脂分化觀察22
• 1.3.9 RT-PCR檢測(cè)成脂基因表達(dá)情況22-23
• 1.3.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析23
• 2 結(jié)果23-24
• 2.1 hADSCs的分離、培養(yǎng)23-24
• 2.2 hADSCs的表型鑒定24
• 2.3 hADSCs成脂誘導(dǎo)分化24
• 2.4 hADSCs成骨誘導(dǎo)分化24
• 2.5 支架對(duì)細(xì)胞毒性測(cè)定24
• 2.6 細(xì)胞粘附觀察24
• 2.7 細(xì)胞外基質(zhì)支架上細(xì)胞成脂分化觀察24
• 2.8 RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)分析24
• 3 討論24-27
• 第三部分 人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架在大鼠軟組織缺損模型中降解的實(shí)驗(yàn)研究27-32
• 1 材料與方法27-29
• 1.1 材料來(lái)源27
• 1.2 主要試劑和儀器27-28
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法28-29
• 1.3.1 人脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)支架的制備28
• 1.3.2 支架材料的處理28
• 1.3.3 大鼠軟組織缺損模型的建立28
• 1.3.5 軟組織缺損模型大體觀察28
• 1.3.6 植入體內(nèi)支架降解觀察28-29
• 1.3.7 體內(nèi)降解支架材料HE染色29
• 1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析29
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-30
• 2.1 大鼠軟組織缺損模型大體觀察29
• 2.2 體內(nèi)植入支架降解大體觀察29
• 2.3 體內(nèi)降解支架材料HE染色29-30
• 3 討論30-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-37
• 在學(xué)期間的研究成果37-38
• 致謝38-39
• 綜述39-45
• 參考文獻(xiàn)43-45
• 附圖45-53

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本文編號(hào)：321046